BarA-UvrY双组分系统在Vibrio harveyi毒力中的作用，以及ΔbarA和ΔuvrY突变株作为减毒活疫苗的有效性评估

本研究通过敲除Vibrio harveyi的barA和uvrY基因，发现突变体在生长、运动性及生物膜形成等方面受影响，并降低宿主细胞铁离子浓度和粘附能力，同时增强对环境胁迫和抗生素的敏感性。疫苗实验表明，突变体能有效激活宿主免疫应答，抑制V. harveyi感染。该研究揭示了BarA/UvrY系统在致病机制中的作用及新型疫苗策略。

张一林|吴凡|郭凯文|文一鸣|甘珍|卢一山

广东省水生动物疾病控制与健康养殖重点实验室，以及广东海洋大学渔业学院水生动物疾病控制重点实验室，中国湛江524088

摘要

作为关键的细菌信号传导机制，两组分系统（TCSs）调控着众多细胞过程，其中BarA/UvrY系统在控制应激适应性和毒力方面尤为重要。然而，在海洋鱼类中引起弧菌病的主要病原体——Vibrio harveyi中，BarA/UvrY的功能仍不明确。在本研究中，我们分析了V. harveyi在删除barA和uvrY后的典型表型变化，结果表明，删除barA和uvrY降低了其最大生长密度和运动能力，并增加了其对pH值应力、铁限制和抗生素的敏感性。此外，V. harveyi的生物膜形成是一个时间依赖的过程。同时，删除barA和uvrY还减少了细菌的粘附能力，降低了细胞内的亚铁离子浓度，同时增加了宿主细胞的凋亡和存活率。进一步研究表明，这种突变损害了细菌侵入和在石斑鱼巨噬细胞内复制的能力。最后，用ΔbarA和ΔuvrY进行免疫接种通过上调免疫相关基因和增加血清酶活性，提供了对V. harveyi感染的有效保护。这些结果为γ-变形菌门的BarA/UvrY调控系统提供了重要见解，并揭示了该病原体在海洋鱼类宿主体内的新致病策略。

引言

细菌已经发展出多种感知和响应机制以应对各种刺激[1]、[2]。在这些机制中，两组分系统（TCSs）是几乎所有细菌物种中普遍存在且功能多样的感知机制[3]、[4]。典型的TCSs包括膜相关组氨酸蛋白激酶（HKs）和响应调节蛋白（RRs）[5]、[6]。大多数HKs包含三个功能域：感应域、传递域和催化域，而RRs的特点是具有可磷酸化的天冬氨酸残基REC域[5]、[6]。TCSs通过HKs和RRs之间的磷酸转移反应在多种细菌生物过程中发挥关键作用[5]、[6]，BarA/UvrY系统是一种被广泛研究的TCS，在革兰氏阴性γ-变形菌物种中普遍存在[7]。

作为经典的TCSs之一，BarA/UvrY因其在Escherichia coli中调节适应性反应的关键作用而闻名[8]，它与Vibrio cholerae的VarS/VarA[9]、Pseudomonas物种和V. fischeri的GacS/GacA[10]、[11]、Salmonella物种的BarA/SirA[12]以及Erwinia物种的ExpS/ExpA[13]具有同源性。重要的是，有研究表明BarA/UvrY对毒力的调节至关重要[12]、[14]。例如，BarA/UvrY不仅调控V. vulnificus和V. cholerae的生长、运动能力、生物膜形成和铁载体/胶原酶的产生[15]、[16]，还参与尿路致病性E. coli（UPEC）中溶血素、脂多糖（LPS）的产生和细胞毒性的负调控[14]。此外，通过非编码小RNA（sRNAs）CsrB/C/D，BarA/UvrY可以间接调节CsrA[7]，而CsrA是E. coli毒力所需的全局调控因子之一[18]。

Vibrio harveyi是一种革兰氏阴性、发酵型的杆状细菌，可引起石斑鱼的弧菌病，该鱼类是东南亚重要的经济海洋鱼类之一[19]、[20]、[21]。目前尚不清楚BarA/UvrY系统在V. harveyi对海洋鱼类宿主致病过程中的具体作用机制。在本研究中，我们探讨了删除barA和uvrY对V. harveyi关键表型的影响，包括生长、运动能力、生物膜形成以及对碱性pH值应力、抗生素和铁限制的敏感性，以及细菌基因表达。我们进一步比较了野生型（WT）和突变株（ΔbarA和ΔuvrY）在粘附GS细胞的能力、细胞内亚铁离子浓度、细胞存活率和凋亡水平方面的差异。此外，该突变还降低了细菌侵入和在石斑鱼巨噬细胞内复制的能力。最后，通过鱼类免疫接种和挑战实验，结合qRT-PCR和酶活性测定以及组织病理学观察，评估了ΔbarA和ΔuvrY作为减毒活疫苗（LAVs）候选物的有效性。我们的发现显著扩展了目前对细菌中BarA/UvrY调控系统的认识，并揭示了V. harveyi在海洋鱼类宿主体内的新致病策略。

部分摘要

细菌已经发展出多种感知和响应机制来应对不同的刺激[1]、[2]。在这些机制中，两组分系统（TCSs）是几乎所有细菌物种中普遍存在且功能多样的感知机制[3]、[4]。典型的TCSs包括膜相关组氨酸蛋白激酶（HKs）和响应调节蛋白（RRs）[5]、[6]。大多数HKs包含三个功能域：感应域、传递域和催化域，而RRs的特征是具有可磷酸化的天冬氨酸残基REC域[5]、[6]。TCSs通过HKs和RRs之间的磷酸转移反应在多种细菌生物过程中发挥关键作用[5]、[6]，BarA/UvrY系统是一种被广泛研究的TCS，在革兰氏阴性γ-变形菌物种中普遍存在[7]。

作为经典的TCSs之一，BarA/UvrY因其在Escherichia coli中调节适应性反应的关键作用而闻名[8]，它与Vibrio cholerae的VarS/VarA[9]、Pseudomonas物种和V. fischeri的GacS/GacA[10]、[11]、Salmonella物种的BarA/SirA[12]以及Erwinia物种的ExpS/ExpA[13]具有同源性。重要的是，有研究表明BarA/UvrY对毒力的调节至关重要[12]、[14]。例如，BarA/UvrY不仅调控V. vulnificus和V. cholerae的生长、运动能力、生物膜形成和铁载体/胶原酶的产生[15]、[16]，还参与尿路致病性E. coli（UPEC）中溶血素、脂多糖（LPS）的产生和细胞毒性的负调控[14]。此外，通过非编码小RNA（sRNAs）CsrB/C/D，BarA/UvrY可以间接调节CsrA[7]，而CsrA是E. coli毒力所需的全局调控因子之一[18]。

Vibrio harveyi是一种革兰氏阴性、发酵型的杆状细菌，可引起石斑鱼的弧菌病，这种鱼类是东南亚重要的经济海洋鱼类之一[19]、[20]、[21]。目前对于BarA/UvrY系统在V. harveyi对海洋鱼类宿主致病过程中的作用机制了解甚少。在本研究中，我们调查了删除barA和uvrY对V. harveyi关键表型的影响，包括生长、运动能力、生物膜形成以及对碱性pH值应力、抗生素和铁限制的敏感性，以及细菌基因表达。我们还比较了野生型（WT）和突变株（ΔbarA和ΔuvrY）在粘附GS细胞的能力、细胞内亚铁离子浓度、细胞存活率和凋亡水平方面的差异。此外，该突变还降低了细菌侵入和在石斑鱼巨噬细胞内复制的能力。最后，通过鱼类免疫接种和挑战实验，结合qRT-PCR和酶活性测定以及组织病理学观察，评估了ΔbarA和ΔuvrY作为减毒活疫苗（LAVs）候选物的有效性。我们的发现显著扩展了目前对细菌中BarA/UvrY调控系统的认识，并揭示了V. harveyi在海洋鱼类宿主体内的新致病策略。

部分摘要（节选）

鱼类、细菌、质粒和细胞

本研究中使用的所有细菌、质粒、鱼类细胞系和引物详见补充表1和补充表2。珍珠龙眼石斑鱼（E. fuscoguttatus × E. lanceolatus，体重50.0 ± 4.0克）来自中国湛江的一家商业水产养殖场。实验前，鱼在25.0 ± 1.0°C的充气、沙滤海水中驯养14天，环境条件受控。每30条鱼被饲养在一个

ΔbarA和ΔuvrY的构建

ΔbarA和ΔuvrY的构建过程如图1所示。上游片段A和下游片段B分别使用BARA-19-F/BARA-UP-R、BARA-DOWN-F/BARA-19-R和UVRY-19-F/UVRY-UP-R、UVRY-DOWN-F/UVRY-19-R成功扩增并重叠（见图1A和D）。片段A、B和pUC19（切割位点：EcoRI-HindIII）通过无缝克隆成功连接，然后将BARA-UD-pUC19和UVRY-UD-pUC19转移到E. coli S17-1λpir中。BARA-H73-F/BARA-H73-R和UVRY-H73-F/UVRY-H73-R

讨论

TCSs被广泛认为是细菌适应环境变化的关键机制[3]、[4]，但在引起石斑鱼弧菌病的典型细菌病原体V. harveyi中，TCSs的作用尚未完全阐明。在本研究中，我们生成了V. harveyi中barA和uvrY的框内缺失突变体，结果表明ΔbarA和ΔuvrY显著影响了多个表型，包括生长、运动能力、生物膜形成和应激反应

数据可用性

RNA-seq数据可在Sequence Read Archive数据库（引用访问码PRJNA1276719）中获取，需受控访问。本研究使用的数据可向相应作者请求获得（[e-mail]）。

作者贡献

Y.Z.和Y.L.设计了本研究。Y.Z.和F.W.实施了研究。数据收集由Y.Z.完成，数据分析由Y.Z.、Z.G.和Y.W.共同完成。数据解释由Y.Z.、Z.G.和Y.W.完成。Y.Z.撰写了手稿，Z.G.和Y.L.修订了内容。Z.G.和Y.L.批准了最终版本的手稿。所有作者均阅读并批准了最终手稿。

伦理声明

所有实验动物方案均符合广东海洋大学的实验室动物护理和使用规定，并获得了学校的批准（GDOU2023006）。

资助

本研究得到了国家重点研发计划（2023YFD2401705）和深圳重大科技专项（KJZD20230923115100002）的资助，以及广东海洋大学的科研启动资金（060302422202）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。