作者：Habasi Patrick Manzi、Dan Qin、Yan Li、Shengwen Zhao、Xiaopeng Yan、Jean Claude Nizeyimana、Qian Sun
中国科学院城市环境研究所先进环境技术国家重点实验室，中国厦门市361021
摘要 解锁不可培养微生物的代谢潜力对于理解新兴污染物的降解过程至关重要。单细胞拉曼激活分选（scRACS）技术为分离功能性细菌提供了突破性方法，但分选后的细胞培养仍然是一个挑战，这阻碍了对其降解机制的深入研究。在这项研究中，我们开发了一种两步培养策略，包括寡营养和富营养条件，以回收和增殖通过拉曼分选得到的单细胞，从而研究双酚A（BPA）的生物转化过程。最终成功培养出一种能够降解BPA的细菌，并鉴定其为Comamonas testosteroni 。生物信息学分析表明，该细菌含有编码BPA降解酶的基因，包括单加氧酶、过氧化物酶、水解酶和羟化酶。膜分泌系统中的tatA 、secA 和gspA 基因表明存在一种用于BPA吸收和副产物排出的运输系统，这一点通过检测到细胞内的13 C12 -BPA得到了验证，证明了scRACS技术能够关联细菌的基因型和表型。利用液相色谱-高分辨率质谱和气相色谱-质谱技术以及气相色谱-燃烧同位素质谱技术对BPA的转化产物进行了鉴定。通过对基因、酶和转化产物的分析，提出了四种生物降解途径。本研究为利用scRACS技术培养细菌细胞及其功能提供了基础性见解，凸显了其在阐明BPA等微污染物生物降解机制方面的潜力。
引言 超过99%的微生物使用标准实验室技术无法培养，这导致了对其原位 功能和代谢潜力的认识存在重大空白[1]。为了解决这一问题，单细胞拉曼激活分选（scRACS）技术应运而生，它能够在培养前筛选出功能性细菌细胞，并在研究实践中获得了广泛认可[2]。例如，利用13 C-碳酸氢盐同位素标记的scRACS技术，研究人员检测到来自海水的活性细菌细胞中由于13 C掺入而产生的特征性拉曼光谱变化，证明Pelagibacter 属细菌能够主动吸收无机碳[3]。同样，结合氘富集技术的scRACS也被用于识别和分离具有原位 有机磷酸盐溶解能力的单细胞[4]。 然而，识别功能性细胞并成功分离目标细胞仅仅是第一步。后续对这些分选单细胞的培养仍面临诸多挑战，需要优化培养条件以确保其存活和增殖[5]。主要难点包括减少分选过程中激光对细胞的损伤，以及选择能够模拟细胞天然营养需求的培养基，这些信息可以从宏基因组数据中推断出来[5],[6]。例如，Luria-Bertani培养基（LB）有利于快速高效地培养生长旺盛的菌株，而Reasoner's 2A培养基（R2A）则适用于分离生长缓慢或受压的细菌[7]。
即使获得了纯培养物，要全面了解其生物修复能力，仍需将遗传信息与其代谢产物联系起来。进一步的研究对于阐明污染物（如BPA）的降解机制至关重要[8]。BPA的生物降解途径多种多样，包括氧化、水解和结合反应，这些反应会产生相应的副产物[9]。在外膜上，由基因编码并通过I型和II型分泌系统分泌的细胞外酶可以启动污染物的降解过程。例如，Pleurotus ostreatus 产生的过氧化物酶已被证实是BPA降解途径中的关键酶[10]。由于BPA具有疏水性，它还可以穿透细胞膜，细胞内的单加氧酶等酶会进一步催化降解反应。产生的中间产物随后通过复杂的分泌系统排出细胞，这些系统由基因编码的功能蛋白调控。要深入了解这些途径，尤其是在单细胞水平上，需要借助生物信息学进行全基因组分析[11]。
细菌细胞诱导的污染物转化产物（TPs）与遗传特征相关[12]，鉴定TPs或代谢物对于确认降解途径至关重要。液相色谱结合高分辨率质谱（如四极杆飞行时间质谱Q/ToF-MS）可以实现TPs的高分辨率非靶向分析[13]。如果在scRACS过程中使用13 C标记的BPA，特征性的同位素信号可以提高TPs鉴定的灵敏度和准确性。此外，气相色谱-燃烧同位素质谱（GC-C-IRMS）可以确定13 C标记化合物的生物来源，结合GC-MS的并行分析有助于其结构表征[14],[15]。虽然scRACS可以识别功能性细胞，但很少有研究将其与培养后分析和多组学研究相结合，以全面阐明特定污染物的生物降解机制[16]。迄今为止，尚未有报道通过scRACS分选出的BPA降解细菌的成功培养案例，以便进行后续分析，包括全宏基因组和转化产物（TPs）分析。
BPA是一种普遍存在的内分泌干扰物，在各种环境样本中都能检测到，因此开发环保有效的修复策略成为研究的重点。此前，我们成功分选出了能够降解13 C-BPA的单细菌细胞。在此基础上，本研究旨在：(a)培养分选出的单细菌细胞；(b)研究其在不同浓度下的BPA降解性能；(c)通过全基因组测序确定其基因型特征；(d)鉴定其转化产物和代谢物；(e)提出BPA的生物转化途径（详见图1）。通过整合单细胞培养、动力学建模、基因组学和转化产物鉴定，本研究全面揭示了功能性细菌在环境解毒中的作用。
通过适当培养基培养BPA降解细菌 本研究使用的培养基、标准和有机试剂详见表S1和S2。拉曼分析从暴露于1 mg/L 13 C-BPA（标记在芳香环((CH3 )2 C(13 C6 H4 OH)2 )的活性污泥细菌群落中识别出13 C标记的细胞[17]。这些细胞随后被分选用于培养。在培养前，通过优化激光功率和暴露时间，使用scRACS技术获得了13 C-BPA标记的单细胞
通过scRACS分选出的高效BPA降解细菌的培养 经过scRACS分选后，成功从单个细胞中培养出一种能够降解BPA的目标细菌。最初在LB肉汤中富集的细菌通过浊度变化被观察到，随后将其接种在LB琼脂上，形成了菌落（见图S2）。选取了三个菌落SC11、SC13和SC16进行鉴定。16S rRNA序列分析显示，这些分离株与Comamonas testosteroni ATCC 11996的相似度高达99%。这一结果得到了EzBioCloud技术的进一步验证
拉曼分选细胞的成功培养 本研究展示了scRACS技术在从复杂微生物群落中直接分离高效BPA降解细菌Comamonas sp. SC11方面的成功应用。主要成就在于克服了单细胞分选过程中遇到的挑战，成功培养出了具有强大降解能力的细菌。分选过程包括离心洗涤、玻片干燥和光谱采集期间的激光照射，这些步骤可能会显著改变细胞环境
结论 本研究克服了将功能性单细胞分选与机制分析相结合的难题。它证明了通过RACS技术成功培养出了一个13 C标记的BPA代谢细菌细胞，并展示了其在BPA去除方面的高效性。全基因组测序确定该细菌属于Comamonas testosteroni ，并发现其携带多种外源物质降解相关基因。多平台分析方法（包括LC-Q/ToF-MS和GC-MS）的结合使用
环境意义 双酚A（BPA）是一种对生态系统和公共健康构成严重威胁的内分泌干扰物。从环境样本中分选和培养BPA降解细菌，并研究其全基因组和BPA转化产物，是提升含BPA废物处理效果的基础。在寡营养和富营养条件下进行的先进分选和培养技术能够回收和增殖BPA降解细菌。这一进展不仅有助于...作者贡献声明 Jean Claude Nizeyimana： 数据可视化、数据分析。
Qian Sun： 撰写、审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、研究设计、资金获取、概念构思。
Shengwen Zhao： 研究实施、数据分析。
Xiaopeng Yan： 研究实施、数据分析。
Yan Li： 研究实施、数据分析。
Habasi Patrick Manzi： 撰写初稿、数据可视化、软件开发、方法设计、研究实施、数据分析、数据整理、概念构思。
Dan Qin： 撰写
利益冲突声明 作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢 感谢Shulan Liu博士和Lai Wei女士提供的优秀技术支持。本研究得到了国家自然科学基金（U24A20516）、福建省重点项目（2025Y0057）、中国科学院国际合作项目（322GJHZ2024084GC）以及中国科学院青年跨学科团队（JCTD-2021-13）的共同资助。
数据获取 数据可应要求提供。
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