引言
随着人口快速增长和全球粮食需求的增加，农业实践日益集约化，导致化肥和农药的广泛使用。其大面积且往往不加区别的施用已造成严重的环境污染，特别是在淡水生态系统中，对生态稳定性和生物健康产生不利后果。农药是农业污染的最主要贡献者之一，它们通过径流和淋溶进入水生系统，改变水化学性质，增加有毒化合物的生物可利用性，从而破坏水生食物网和生物体的生理过程。
毒死蜱（Chlorpyrifos, CPF）是一种广泛使用的有机磷杀虫剂，在地表水中的浓度已被检测到超过监管阈值。其毒性主要源于对乙酰胆碱酯酶的抑制，导致胆碱能神经传递受损。在鱼类中，CPF暴露与行为紊乱和存活率降低有关。除神经毒性外，CPF还能破坏对维持内环境稳定至关重要的生理过程，如离子调节和能量代谢。
盐度是影响鱼类生理的关键非生物因子，直接影响离子转运、水通透性和渗透调节的能量需求。鳃是离子交换的主要场所，因此特别容易受到环境污染物影响。重要的是，盐度可以通过改变水化学和鳃膜转运过程来改变农药的毒性、吸收和生理效应。然而，大多数毒理学研究是在恒定盐度条件下检验农药效应的，这限制了我们理解化学胁迫如何与淡水鱼类的渗透胁迫相互作用。
在分子水平上，渗透调节控制依赖于膜转运蛋白，如Na+/K+-ATP酶（NKA）和水通道蛋白（Aquaporins），特别是水通道蛋白3（AQP3），它们调节鳃和肾上皮中的离子梯度和水运动。环境污染物，包括有机磷农药，可以通过损害ATP依赖的过程和氧化代谢来下调这些转运系统，从而破坏离子和水平衡。
然而，关于CPF暴露和盐度升高对淡水鱼类渗透调节生理和基因表达的联合影响仍知之甚少。解决这一知识空白日益重要，因为气候变化导致内陆水域盐碱化。因此，本研究旨在探究CPF暴露是否会破坏鲤鱼（Cyprinus carpio）的渗透调节功能，以及盐度升高是否会加剧这些效应。研究假设CPF会损害血浆离子稳态并下调nka和aqp3基因表达，且在高盐度条件下效应更为显著。
材料与方法
实验鱼与伦理批准
总共180尾平均体重为20 ± 1 g的鲤鱼幼鱼从当地孵化场获得并运至实验室。鱼在含有除氯自来水的玻璃水族箱中连续充气驯化两周。驯化期间，每天投喂两次商业饲料，并清除残饵和粪便以维持水质。所有实验程序均按照机构动物护理和使用指南进行，并获得了霍拉姆沙赫尔海洋科学与技术大学伦理委员会的批准。
实验设计与CPF暴露
驯化后，将鱼随机分配到设定为三种盐度水平（4、8和12 ppt）的水族箱中，盐度水平的选择基于先前对鲤鱼的研究。通过将商业海盐溶解于除氯自来水中来调节盐度，并使用校准的折射计每日验证。每种盐度下设立六个重复水箱（每箱10尾鱼，每种盐度60尾鱼）。在每个盐度水平内，三个水箱作为对照组，三个水箱暴露于名义浓度为15 µg L-1的CPF，该浓度相当于该物种96小时半致死浓度（LC₅₀）的1/50。每日监测水质参数（温度、pH、溶解氧和硬度）。为维持水质并近似稳定的CPF暴露，每日更换三分之一的水体积，并相应重新添加CPF。尽管未对CPF浓度进行分析验证，但暴露方案遵循了农药毒性研究中常用的标准半静态更新设计。此局限性已得到承认。
血液采样与血浆生化分析
暴露14天后，禁食24小时以尽量减少食后变异。用200 mg L-1丁香油麻醉鱼，使用肝素化注射器从尾静脉采集血样。血浆在4°C下以3,000 × g离心10分钟分离，并储存于-80°C。使用自动电解质分析仪测量血浆Na+、Cl-和K+浓度。总蛋白（TP）通过双缩脲法测定，葡萄糖使用GOD-POD酶促比色试剂盒测定。
鳃组织采样
采血后，用过量丁香油安乐死鱼。从每箱随机选取的三尾鱼上无菌摘取第二左鳃弓。由于每个处理包含三个重复水箱，因此每个处理组总共使用9尾鱼进行基因表达分析。每尾鱼代表一个独立的生物学重复，鳃组织单独处理。样品在冰生理盐水中短暂冲洗，液氮速冻，并储存于-80°C直至RNA提取。
RNA提取与实时定量PCR
使用High Pure RNA Tissue Kit从约25 mg鳃组织中提取总RNA。通过NanoDrop分光光度法和琼脂糖凝胶电泳验证RNA纯度（A260/A280 > 1.8）和完整性。使用商业逆转录试剂盒，以随机六聚体和MMuLV逆转录酶从1 µg RNA合成第一链cDNA。在Rotor-Gene 3000系统上使用SYBR Green Master Mix进行实时定量PCR。靶基因包括Na+/K+-ATP酶（nka）和水通道蛋白3（aqp3），以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因。通过熔解曲线分析确认引物特异性。使用BestKeeper软件验证内参基因稳定性，显示各处理间Ct值变异最小。qPCR效率在95–105%之间，R²值 > 0.99。使用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达量。
统计分析
数据以平均值±标准差表示。使用Shapiro-Wilk检验和Levene检验分别评估数据的正态性和方差齐性。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）评估盐度、CPF暴露及其交互作用（盐度 × CPF）的主效应。当检测到显著效应（p < 0.05）时，使用Duncan多重范围检验进行事后比较。使用SPSS v25.0进行统计分析。
结果
生化参数
在不同盐度和CPF暴露条件下，鲤鱼血浆生化参数总结如表2所示。双因素方差分析显示，盐度和CPF暴露对血浆葡萄糖浓度有显著主效应（p < 0.05），且盐度与CPF之间存在显著的交互作用（p < 0.05）。在未暴露CPF的鱼中，血浆葡萄糖水平随盐度梯度升高而增加。在CPF暴露组中，葡萄糖浓度随盐度水平变化，且在8和12 ppt时低于相应的未暴露对照组。总蛋白（TP）水平受CPF暴露影响显著（p < 0.05），而盐度单独无显著主效应（p > 0.05）。盐度与CPF的交互作用对TP不显著（p > 0.05）。在所有盐度下，CPF暴露鱼的TP浓度均低于未暴露组。在未暴露鱼中，血浆Na+和Cl-浓度随盐度升高显著增加（p < 0.05）。CPF暴露导致所有盐度水平下的Na+和Cl-浓度显著降低（p < 0.05）。双因素方差分析表明，盐度与CPF对Na+和Cl-均有显著的交互效应（p < 0.05）。血浆K+浓度未受盐度、CPF暴露或其交互作用的显著影响（p > 0.05），尽管在各实验组间观察到微小的数值变化。
基因表达
鳃组织中nka的相对表达量如图1所示。双因素方差分析显示，盐度和CPF暴露对nka转录水平有显著主效应（表3，P < 0.05），且盐度与CPF之间存在显著的交互作用（P < 0.05）。在未暴露鱼中，nka表达随盐度升高而增加。CPF暴露鱼在所有盐度下均表现出低于相应未暴露组的nka mRNA水平。
鳃组织中aqp3的相对表达量如图2所示。在未暴露鱼中，aqp3表达随盐度梯度升高而增加。在CPF暴露组中，所有盐度下的aqp3转录水平均降低（P < 0.05）。CPF暴露对aqp3转录本丰度有显著影响（P < 0.05），盐度也产生显著主效应（P < 0.05）。检测到盐度与CPF对aqp3表达存在显著交互作用（表3，P < 0.05）。
讨论
生化参数
血浆葡萄糖和蛋白质水平是鱼类生理应激的公认指标，为了解毒物暴露的代谢后果提供了宝贵信息。在本研究中，CPF引发了双相葡萄糖反应，其特征是初期高血糖，随后随着暴露时间延长出现显著下降。这种模式与Wendelaar Bonga描述的一般应激反应一致，即血浆葡萄糖的急性升高源于皮质醇和儿茶酚胺介导的糖原分解，而在持续毒物胁迫期间伴随能量储备的耗竭。在暴露于CPF的莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）和露塔拉比鱼（Labeo rohita）中也报道了类似的双相葡萄糖趋势，证实长期暴露会损害碳水化合物代谢和肝糖异生。
观察到的血浆总蛋白减少可能源于CPF诱导的应激下肝脏蛋白质合成减少和蛋白质分解增强。已知有机磷农药会诱导氧化应激、线粒体功能障碍并抑制蛋白质翻译机制，最终导致血浆蛋白水平耗竭。
本研究观察到的CPF毒性的一个关键特征是在所有盐度水平下血浆Na+和Cl-浓度显著降低，且在12 ppt时下降幅度最大（P < 0.05）。这种离子失衡表明鳃离子转运受损，与观察到的nka和aqp3表达下调一致。在淡水和广盐性硬骨鱼类中，离子梯度的维持主要由鳃离子细胞中Na+/K+-ATP酶的活性介导。本研究中观察到的nka表达减少与早期报道CPF抑制Na+/K+-ATP酶活性的研究相符。
nka和aqp3表达的变化
在分子水平上，CPF显著抑制了鲤鱼鳃组织中nka和aqp基因的转录。这两个基因在渗透调节适应中起着关键作用：nka维持离子交换所需的电化学梯度，而aqp促进水跨上皮膜转运。在CPF暴露鱼中观察到的这些基因下调表明，CPF干扰了细胞能量代谢以及膜蛋白的表达和功能，如先前报道。
先前研究表明，重金属、碳氢化合物和有机磷等污染物通过氧化损伤、内分泌干扰和抑制ATP产生来抑制渗透调节基因表达。此外，CPF暴露下aqp表达减少可能代表一种旨在最小化毒物胁迫的适应性反应。
结果还强调了盐度和农药暴露对渗透调节的交互影响。在未暴露条件下，盐度升高诱导nka和aqp表达上调，反映了对渗透压升高的正常生理调节。然而，这种补偿性反应被CPF抑制，表明农药毒性损害了鱼类适应盐度变化的能力。Hutton等人报道了类似的相互作用，他们证明盐度升高可通过增强生物利用度和跨鳃膜吸收而加剧农药毒性。
对渗透调节基因表达的最强调抑制，连同最严重的离子失衡，出现在12 ppt时，该盐度接近报道的鲤鱼耐受上限。这一发现表明CPF效应在高盐度条件下最为显著，并强调了在评估污染物毒性时，跨越环境相关盐度梯度的重要性，特别是对于可能遇到咸淡水环境的淡水物种。
总体而言，本研究证明CPF暴露诱导鲤鱼出现低血糖、低蛋白血症、离子失衡以及nka和aqp基因的转录下调。破坏程度随盐度增加而增加，表明存在盐度依赖的交互胁迫效应。从生态学角度来看，这些损伤对CPF污染栖息地中的鱼类健康具有重要意义。然而，结论受到使用单一CPF浓度、相对较短的暴露持续时间、缺乏水体CPF浓度的分析验证以及生物学重复数量有限等因素的限制。因此，结果应解释为盐度调节CPF毒性的证据，而非全面的生态风险指标。
数据可用性声明
数据将根据要求提供。
