引言
纳米纤维素源于木材、植物等天然资源，因其优异的物理化学特性及可持续性，在材料科学、生物技术、化妆品和医药领域备受关注。纳米纤维素的生产涉及将细胞壁中紧密堆积的纤维素原纤解离为纳米级单元，该过程需克服原纤间强大的吸引力，通常通过化学预处理引入磷酸基、羧酸基、硫酸基或氨基等官能团以提高解离效率。这些表面化学修饰赋予纳米纤维素多样的形貌和表面化学性质，从而调控其化学、力学及流变性能。然而，原子尺度的表面化学结构解析仍是巨大挑战。传统显微技术（如透射电镜TEM和原子力显微镜AFM）及X射线散射虽能观测形貌和晶体结构，但缺乏原子级化学信息分辨能力；元素分析和能量色散X射线光谱可提供定量原子信息，却无法直接捕捉表面结构细节。固体13C交叉极化魔角旋转核磁共振（CPMAS NMR）能表征局部原子环境，但受限于13C天然丰度（约1.1%）导致的低灵敏度。动态核极化（DNP）增强NMR技术通过电子-核自旋极化转移实现信号大幅提升，为纳米纤维素表面原子级研究开辟了新途径。
方法
研究以磷酸化纸浆为原料，经机械均质化与超声处理制备磷酸化纤维素纳米纤维（P-CNFs），通过电位滴定测定磷酸基团解离质子量。原子力显微镜（AFM）观测显示P-CNFs在水分散体系中呈单根分散，沿原纤轴呈现周期性扭曲形态，扭结周期约50纳米，高度分布（2.1-3.8纳米）与18链纤维素原纤模型一致。DNP增强固体NMR实验在400 MHz谱仪上于105 K进行，使用AMUPol自由基作为极化剂。多维NMR实验包括13C–13C INADEQUATE、31P–13C TEDOR及31P–31P S3双量子-单量子相关谱，定量多CP（multiCP）分析用于测定磷酸化程度与构象分布。分子动力学（MD）模拟基于纤维素Iβ的18链模型构建P-CNFs结构，磷酸化位点比例（C2:C6=25:75）与总电荷量（2.29 mmol g–1）参照NMR数据设定，在TIP3P水溶液中进行15 ns模拟。密度泛函理论（DFT）计算采用Quantum ESPRESSO软件包，通过PBE泛函与DFT-D3范德华校正优化表面模型，分析磷酸化C6基团的相对能量与氢键相互作用。
结果与讨论
形态学表征显示P-CNFs具有典型的右手性扭曲结构，扭角为4.2°/nm，与AFM观测结果高度吻合。DNP增强NMR实验获得约30倍的信号增强，使自然丰度样品的高维谱图采集成为可能。31P CPMAS谱显示单磷酸与二磷酸基团比例为84:16。13C–13C INADEQUATE谱清晰揭示了葡萄糖单元内碳原子间耦合，C6羟甲基区出现三个主峰，对应非磷酸化C6的三种旋转异构体（tg、gt、gg）。31P–13C TEDOR谱在短混合时间（1 ms）下显示出磷酸基团与C2/C6碳的空间邻近性，证实磷酸化主要发生于C2与C6位。C2位磷酸化引起化学位移向低场移动约2.6 ppm（至74.8 ppm），而C3位因与相邻糖环氧原子形成分子内氢键，反应活性较低。定量multiCP分析表明，C6位磷酸化程度为16.9%，其中P-gt与P-gg构象比例为79:21。基于18链模型（表面可及C6占三分之一），推算约50.7%的表面C6被磷酸化。结合滴定数据，进一步得出表面C2位磷酸化比例约为暴露C2的六分之一，即表面葡萄糖单元中约三分之一携带磷酸基团。
31P–31P S3相关谱通过双量子相干过滤检测空间邻近磷原子。二磷酸单元内P–P距离为2.64 Å，对应P–O–P键角约113°；单磷酸单元间自相关峰拟合得出平均距离为4.51 Å，指示表面磷酸基团在相邻葡萄糖链上的最短空间分布。MD模拟生成的P–P径向分布函数最强峰位于5.0 Å，与NMR数据一致，且对应模型中相邻链磷原子间距。模拟体系中原纤呈现与实验一致的右旋扭曲，扭结周期约86纳米。C6构象分布分析显示，原纤核心非磷酸化C6在原点链中以tg构象为主，中心链偏好gg构象，后者可通过羟甲基与相邻原点链C2羟基形成氢键稳定。整体C6构象分布（tg36.5%、gt28.1%、gg18.6%、P-gt13.3%、P-gg3.6%）与multiCP定量结果高度吻合。表面磷酸化C6构象受晶面与链类型显著调控：（1 1 0）面因空间位阻与分子内氢键（O3′–H···O6/O5）稳定，几乎全部采用P-gt构象；（1 1̅ 0）面原点链中P-gg构象占优（63.2%），因其可避免相邻链空间干扰并与邻链C2羟基形成分子间氢键；中心链则因P-gt构象氢键稳定能力而略占优势（52.6%）。
DFT计算进一步从能量角度验证构象偏好。（1 1 0）面上P-gt构象比P-gg稳定9.4–33.6 kJ mol–1，主要归因于氢键稳定；（1 1̅ 0）面原点链中P-gg构象能量略低，因其可形成分子间氢键且避免空间冲突。基于玻尔兹曼分布的构象种群预测与MD模拟结果高度一致。
结论
本研究通过DNP增强NMR技术首次实现了磷酸化纳米纤维素表面原子级结构的精准解析，结合计算模拟揭示了磷酸基团的位点选择性、空间分布及构象调控机制。该多学科方法不仅深化了对纳米纤维素表面化学的理解，也为其他功能化多糖材料的原子级表征提供了范例，对设计高性能生物基材料具有重要指导意义。
