1 引言
滑膜在可动关节（如膝关节）中扮演关键角色。健康的滑膜通过产生滑液维持关节稳态和润滑。滑膜是一种特殊的结缔组织，覆盖关节囊内侧，可分为衬里层和衬下层。衬里层由几层成纤维样滑膜细胞（FLS）和常驻巨噬细胞组成，负责清除细胞碎片和调节关节炎症。衬下层则由血管化的胶原基质组成，其中散布着FLS、脂肪细胞、巨噬细胞和各种其他免疫细胞。
滑膜也参与全关节关节炎疾病（如骨关节炎（OA）和类风湿关节炎（RA））的发病机制。在RA和一部分OA患者中，会发生滑膜纤维化，其特征是衬下层细胞外基质（ECM）过度沉积，最终导致关节僵硬和疼痛。在OA和RA中，滑膜炎导致FLS活化和迁移，破坏正常的细胞通讯，增强细胞因子和生长因子的产生，并增加基质降解酶的释放。滑膜炎还刺激新生血管生成、促炎和抗炎巨噬细胞群之间的失衡以及免疫细胞从附近血管浸润。
迄今为止，缺乏足够的模型来模拟滑膜在健康和疾病状态中的作用。传统上，使用的是缺乏生理相关性的动物模型或过于简化的体外模型。为了更好模拟人体组织的生理复杂性，器官芯片（OoCs）已成为传统体外模型的有前途的替代方案。OoCs是人体组织的微工程模型，具有控制（生物）机械和化学刺激以及细胞微环境的独特功能。目前，已有少量滑膜芯片（SoC）模型被报道。然而，现有模型常常忽略常驻免疫成分，并且未能完全覆盖或在相关尺度上以可控方式研究FLS、巨噬细胞和内皮细胞之间复杂的细胞间相互作用。
为了应对这一挑战，本研究提出了一个全PDMS双室SoC平台，其特点是具有独特的2 µm厚、带有5 µm圆形孔的微孔PDMS膜，支持化学通讯以及类似于细胞尺度的细胞迁移和相互作用。本研究重点在于建立该平台及其基础方法学，为未来更深入的关节炎机制研究奠定基础。
2 结果
2.1 采用三重共培养模型的SoC平台的开发与优化
为了模拟和研究滑膜在健康和关节炎条件下的状态，我们设计了一个SoC平台，该平台具有两个重叠的培养室（TOP和BOT），由一个水平的2 µm厚微孔膜分隔。该平台还包括一个位于芯片顶部的储液层，以确保TOP和BOT通道之间的完全培养基分离，并为长期细胞培养提供足够的营养输送。
我们接下来优化了细胞接种程序，以建立包含FLS、HUVECs和常驻巨噬细胞成分的三重共培养。在聚多巴胺和胶原蛋白1涂层以促进细胞粘附后，所有细胞类型在SoC装置中培养长达十天。首先，在Day -1将FLS接种在膜上的TOP通道中，以建立滑膜衬里的第一部分。随后，在Day 0，将HUVECs引入BOT室的底部以及膜的底部，以形成模拟滑膜衬下层的内皮管腔。最后，在Day 3将THP-1来源的巨噬细胞注射到TOP室中以完成滑膜衬里，同时将该TOP室中的培养基切换为THP-1培养基以保持其活力。无标记共聚焦反射显微镜显示膜两侧均存在细胞层，表明不同细胞类型的成功整合。接下来，我们通过共聚焦显微镜检查了所有三种细胞类型在膜上的特定分布。THP-1来源的巨噬细胞很好地整合在FLS之上，并保持在膜的顶部直至Day 10，而表达红色荧光蛋白（RFP）的HUVECs则位于膜下方的BOT室中。
接下来，我们进一步表征了SoC的BOT通道中内皮管腔的形成。HUVECs从Day 2开始形成矩形管腔，遵循通道的几何形状，显示紧密堆积的铺路石样细胞和清晰的细胞间连接，这通过Day 5时细胞连接处VE-钙粘蛋白的表达得到证实。最后，我们通过免疫荧光和共聚焦显微镜证实了FLS和THP-1来源的巨噬细胞表达体内健康滑膜的特征性标志物。FLS表达钙粘蛋白11，这是滑膜衬里形成的重要标志物。THP-1来源的巨噬细胞在Day 10表达巨噬细胞标志物CD163。总之，这些结果证实了在十天内在我们的SoC平台中建立了一个三重共培养模型，包括具有连接VE-钙粘蛋白表达的内皮衬里和常驻巨噬细胞成分。
2.2 SoC平台中FLS迁移诱导的自发性内皮管腔重塑
有趣的是，在 triple co-culture 实验中，从Day 5开始，底部小室中的HUVECs从通道壁脱离，同时形成管腔结构，这通过Day 3（重塑开始前）和Day 10的VE-钙粘蛋白染色装置的3D共聚焦显微镜证实。HUVECs开始形成椭圆形管腔，同时保留连接VE-钙粘蛋白的表达，表明内皮衬里保持完整。为了评估这种重塑的可重复性和进展，我们进行了四次独立的实验运行，系统性地测量了在培养期间，对于已建立的三重共培养模型或仅包含底部小室内皮的单培养对照，从RFP通道图像测量的投影管腔宽度。对于后者对照，平均投影宽度在整个培养期间保持恒定，大致等于通道宽度1300 µm。相比之下，对于三重共培养，虽然Day 2的初始投影宽度与对照一致，但它逐渐减小。线性混合模型分析显示，从Day 6开始，仅HUVEC对照组和三重共培养组之间存在统计学显著差异。最后，我们在Day 10使用4 kDa FITC-葡聚糖探针验证了内皮管腔的屏障功能。最初，管腔保留了FITC-葡聚糖探针，证实了屏障的形成，但几分钟后，染料开始泄漏到周围环境，考虑到所使用的FITC葡聚糖探针的低分子量（MW），这是预期的。
鉴于源自关节炎关节的FLS已知具有迁移性，我们假设FLS通过多孔膜迁移到底部小室，包围内皮管腔，导致组织重塑。为了验证这一假设，用CellTracker绿色标记FLS以在装置中随时间追踪它们。在Day 10，3D共聚焦显微镜证实了FLS的重新分布：它们在整个BOT小室中被发现，不仅在膜侧，而且在通道底部，以及在装置全长一半高度的内皮外管腔周围空间。总之，FLS包围了表达RFP的HUVEC为基础的管腔，占据着管腔外空间。FLS和内皮细胞的这种明显的自组织与先前在滑膜组织学切片中的发现一致。此外，我们证实FLS表达CD90，这与先前在滑膜中的发现一致。综上所述，这些数据证实FLS通过膜上的5 µm孔径迁移，定植于底部小室，这很可能是SoC装置中发生内皮重塑的原因。
2.3 内皮细胞迁移和表型转变响应FLS
与内皮管腔重塑并行，在部分三重共培养模型中，发现源自BOT小室的表达VE-钙粘蛋白的细胞出现在TOP小室中，表明同时发生了血管生成出芽。受此观察触发，我们进一步检查了BOT小室中内皮细胞的形态及其VE-钙粘蛋白表达。有趣的是，虽然内皮细胞在Day 3表现出传统的铺路石样形态，但在Day 10表现出更细长的形态。尽管有这些形态变化，VE-钙粘蛋白的表达得以保留，表明内皮特性和屏障功能在整个培养期间得以维持。这种意外的形态变化通过基于机器学习的细胞分割（使用Cellpose）在细胞面积、纵横比和Feret角方面进行了定量表征。对于分割，我们使用了在Day 3、5和10于BOT小室的通道底部和膜区域拍摄的VE-钙粘蛋白共聚焦显微镜图像。该分析揭示了在培养期间这些形状描述符的显著变化。最初，从Day 3到Day 5，底部附着和膜附着细胞的细胞面积均增加，随后在Day 10，膜附着细胞的细胞面积恢复至Day 3的值。相反，底部附着细胞的表面积相对于Day 3仍然升高。纵横比在Day 3时BOT小室两个位置之间无显著差异，但在Day 5时膜上的纵横比略高于底部。在Day 10，膜上细胞的纵横比显著高于底部附着细胞。对于装置中的两个位置，纵横比从Day 3到Day 10持续增加。SoC装置中内皮细胞的这种体外伸长，尽管在没有动态施加流体的情况下发生，与先前描述内皮细胞对血管内皮生长因子（VEGF）反应的报告一致，预计VEGF由我们模型中的FLS释放，如先前在与成纤维细胞直接共培养中所报告。此外，细长的内皮细胞在Day 10相对于芯片水平轴（如定义）以大约60度（底部）或130度（膜）的方向自行取向。值得注意的是，在Day 3和Day 5没有优先取向。值得注意的是，所有这些表型变化在SoC装置中的HUVEC单培养中均不存在，而在初步实验中，在缺乏THP-1来源的巨噬细胞的情况下，在SoC装置中FLS和HUVECs的共培养中观察到管腔重塑。总之，这些表型转变和Day 3至Day 10之间的管腔重塑表明SoC装置中的内皮层和滑膜模型发生了动态变化，这很可能是共培养、细胞间相互作用和细胞迁移的结果。
2.4 TNF-α刺激诱导可溶性炎症介质的释放
在SoC中建立具有常驻免疫成分的三重共培养模型后，我们接下来研究了该SoC模型对炎症条件的反应，作为体外滑膜炎的替代。为此，SoC模型按上述方法培养，同时从Day 6开始每天向TOP室添加10 ng mL-1TNF-α进行刺激。在Day 7至Day 10收集TOP室的培养基，并使用常规Luminex检测法分析IL-6、IL-8、IL-1β、CCL2、GM-CSF和IFN-γ的分泌，以全面了解SoC模型中的炎症状态。该分析揭示了在炎症条件下，与对照相比，IL-6、IL-8、CCL2和GM-CSF明显上调。值得注意的是，这些细胞因子虽然并非关节炎特异性，但高度参与OA和RA的发病机制。例如，CCL2在体内增强单核细胞募集和分化，并与OA的进展相关。有趣的是，未观察到IL-6、IL-8和CCL2表达的时间依赖性趋势，其在TNF-α处理模型中的表达保持比对照（未处理模型）高约6-10倍（IL-6, IL-8）或约3倍（CCL2）。最后，对于IFN-γ，未发现与TNF-α刺激的明确相关性，并且IL-1β表达水平总体较低。总之，成功建立了与关节炎间接相关的功能性炎症表型，验证了我们的SoC模型用于未来滑膜炎研究。
2.5 TNF-α刺激改变了SoC模型中的ICAM-1表达模式
除了研究SoC中的炎症分泌组，我们还研究了在炎症条件下BOT室中内皮细胞ICAM-1的表达，鉴于其在单核细胞粘附中的重要作用，这直接涉及关节炎中的白细胞浸润。ICAM-1免疫荧光染色显示，与未处理的对照相比，TNF-α处理的模型表现出明显更显著的表达模式。确实，放大观察细胞发现，ICAM-1表达模式与TNF-α处理模型中HUVECs的RFP信号重叠，而在未处理的对照模型中只有少数细胞呈现这种模式。值得注意的是，我们在未处理模型中观察到ICAM-1的弥漫性表达，这与先前的工作形成对比，在先前工作中，在未处理条件下观察到很少或没有ICAM-1表达。对此差异的一个可能解释是，在我们的工作中，我们使用了从OA患者分离的FLS，而在先前的工作中，考虑的是无关节炎病史的人类受试者（健康FLS）。已知OA-FLS表达ICAM-1，特别是在体外扩增后。随后通过共聚焦显微镜在SoC装置的TOP室中证实了FLS在炎症条件下表达ICAM-1。因此，仍然可以得出结论，从TOP室刺激SoC模型增加了BOT室中内皮细胞的ICAM-1表达。结合Luminex检测结果，这些数据证实了SoC模型中炎症表型的成功生成。
3 讨论
滑膜中的细胞间相互作用、细胞迁移和炎症介质的释放在关节炎的发病机制中是重要事件。然而，当前的体外滑膜模型并不总是包含必需的免疫元素，并且只有部分模型支持在相关空间尺度上的细胞间相互作用。为了解决这些局限性，我们生物工程化并验证了一种替代的双室SoC平台，该平台包含常驻免疫成分和患者来源的FLS，通过2 µm厚的微孔PDMS膜与重塑中的内皮管腔分隔，该膜支持细胞迁移和多细胞相互作用。总之，我们提出了一个SoC平台，该平台可以按照晶圆级制造工艺以可重复的方式制造，并将在未来解决关节生物学和关节相关疾病中复杂的生物学问题方面发挥重要作用。
为了模拟滑膜的衬里和衬下层结构，我们成功地在我们的装置中建立并维持了患者来源的FLS、HUVECs和THP-1来源的巨噬细胞的三重共培养长达十天，并表达了钙粘蛋白11、VE-钙粘蛋白和CD163。共聚焦显微镜证实了体内样滑膜结构的重建，THP-1来源的巨噬细胞和FLS引入膜的顶部，HUVECs在另一侧。在SoC模型中，从Day 5开始观察到通过底部小室内皮重塑形成可重复的管腔，发现这与FLS从TOP室迁移到BOT室最终包围内皮有关。这些过程在SoC中重建了衬下层样结构，尽管是单一血管管腔。此外，观察到从BOT室到TOP室的内皮出芽，并在三重共培养模型中观察到内皮细胞形态的显著变化。具体来说，内皮细胞随时间显著伸长并排列整齐，即使在没有流体诱导的剪切应力的情况下。这些观察在所有实验运行中一致，表明这些变化是三重共培养模型的特征。
近年来，在OA和RA中发现了越来越多的FLS表型，并且众所周知，在孤立环境中研究FLS可能引入偏差，因为细胞的表型高度依赖于其微环境。因此，我们的SoC平台可用于在更相关的环境中筛选不同的FLS表型。此外，我们假设通过整合各种关节炎相关的FLS表型，可以创建疾病模型，不仅有助于增加我们对关节炎的理解，还可用于靶向药物开发。
在这项工作中，主要旨在开发一个用于未来研究关节炎和机制生物学的技术平台，我们在SoC模型中采用了THP-1来源的巨噬细胞作为常驻免疫成分。该细胞系最终应被从患者血液中分离的原代单核细胞产生的更成熟和疾病相关的巨噬细胞表型所取代，以期创建患者特异性模型。
我们当前SoC模型的一个局限性是缺乏机械刺激，这在体内关节运动过程中常见，并且已被证明对例如体外软骨分化至关重要。我们的平台可以通过结合气动驱动室来进行这些研究，结合2 µm厚的弹性多孔膜，允许对膜上培养的细胞进行动态拉伸。
另一个局限性是我们三重共培养模型中THP-1来源的巨噬细胞的未知且可能异质的作用，这应在未来进行更深入的研究，以揭示FLS-巨噬细胞相互作用，预计这在关节炎中是相关的。在这项作为所提出的SoC平台概念验证的研究中，未详细研究巨噬细胞的功能状态，考虑到THP-1在表面标志物水平上对极化刺激的潜在异质性反应。
最后，本工作中考虑了一个单一的OA-FLS供体，目的是建立和验证平台及三重共培养。鉴于OA-FLS细胞来源于病变组织，炎症或纤维化过程可能已在我们的对照实验中被触发，即使在缺乏TNF-α刺激的情况下。尽管如此，仍能观察到对TNF-α刺激的显著差异反应，伴随着IL-6、IL-8、CCL2和GM-CSF的上调，说明我们的模型支持与未刺激对照的相对比较和基础炎症研究。
4 结论
在这项工作中，我们建立了一个SoC平台，并将其定位为一种用于体外研究滑膜的赋能技术。我们的SoC平台包含常驻巨噬细胞成分、患者来源的FLS和内皮管腔，集成在一个包含薄微孔膜的装置中，支持直接和间接的细胞间通讯以及细胞迁移。我们揭示了FLS和内皮细胞之间的相互作用导致细胞迁移和片上组织重塑，从而模拟了滑膜生物学在健康和关节炎疾病状态中的关键方面。我们已经证明我们的SoC模型在关节炎背景下对诱导的炎症反应有响应。总之，我们相信我们的SoC平台将有助于研究滑膜在关节健康和疾病中的作用，具有在药物开发中应用的潜力，通过新靶点发现和药物筛选，可能以患者特异性的方式进行。
