合成相分离无膜细胞器的设计策略
无膜细胞器（MLOs）是通过液-液相分离（LLPS）形成的动态细胞微环境，能够选择性浓缩特定分子并调控生化反应。基于天然MLOs的工作机制，研究人员设计了多种合成MLOs，这些MLOs在调控酶活性、优化代谢通路、调控基因表达、生产重组蛋白和开发功能生物材料等方面展现出巨大应用潜力。
合成MLOs的构建通常包含支架分子和客户分子两个基本组分。支架分子通过多价弱相互作用驱动相分离，决定MLOs的关键材料性质；客户分子则通过特异性相互作用被招募到MLOs中，赋予合成区室特定功能。目前主要使用的支架分子包括天然无序蛋白（IDPs）、多价模块化结构域和核酸等。
天然与人工无序蛋白支架
IDPs因其缺乏稳定三级结构和富含低复杂度序列（LCSs）的特性，能够通过静电、π-π/阳离子-π、氢键和疏水作用等多价弱相互作用发生LLPS，形成具有快速分子交换能力的液体样凝聚体。例如，FUS家族蛋白的朊病毒样低复杂度结构域（PLCDs）和LAF-1的RGG结构域都在不同系统中展现出强大的相分离能力。
为了克服天然IDPs的复杂性和异质性限制，研究人员开发了人工IDPs（A-IDPs）和从头设计的多肽。这些设计通常采用基于重复的"贴纸-间隔"架构，允许理性调节相分离参数。例如，基于GRGDSPYS的A-IDPs在体外和活细胞中均表现出良好的LLPS特性，能够可调地隔离酶并调节催化效率。
模块化结构域与核酸支架
与IDPs依赖分布式弱相互作用不同，多价模块化结构域通过明确的、可调的折叠域-配体相互作用驱动相分离，形成具有更高可预测性和控制性的致密有序网络。SH3结构域与脯氨酸富集模体（PRMs）的相互作用以及SUMO结构域与SUMO相互作用模体（SIMs）的结合是两种代表性支架系统。
核酸也可作为有效的支架驱动MLOs形成。RNA分子能够通过特定序列基序自发形成凝聚体，重现天然MLOs的功能。例如，Guo等人在大肠杆菌中构建的转录工程可寻址RNA溶剂液滴（TEARS）利用47次重复的CAG三核苷酸RNA序列作为相分离结构域，通过RNA适体-蛋白质相互作用招募客户酶，显著增强了酶促反应效率。
MLOs的物理性质表征
系统评估物理性质对于合成凝聚体的理性设计和应用至关重要。荧光显微镜是验证体外和体内凝聚体形成及空间组织的主要工具。通过共聚焦成像可以观察荧光蛋白标记的支架和客户分子，揭示液滴的存在、尺寸分布和亚细胞定位。
MLOs的流动性是其功能实现的关键物理特性。荧光漂白恢复（FRAP）技术广泛应用于研究体内外凝聚体的动态特性。典型的LLPS系统中，短的荧光恢复时间和高的恢复速率表明快速的分子交换和液体样行为。荧光漂白损失（FLIP）技术则通过连续漂白特定区域同时监测相邻未漂白区域的荧光强度变化，补充FRAP的不足。
相图构建为了解和控制体内外相分离行为提供了定量见解。经典的二元相图将一个关键组分（如蛋白质或RNA）的浓度作为一个坐标，将温度、盐浓度或pH等作为另一个坐标，由此产生的曲线（双节线）包围了稀相和浓相共存的两相区域。
生物技术应用前沿
酶活性调控与代谢通量优化
合成MLOs通过空间区室化酶和底物，为酶促反应提供了精确的时空控制。通过将酶和底物浓缩在特定区域，MLOs显著提高了它们的局部浓度，从而促进酶活性。例如，将SUMO化酶和底物招募到合成凝聚体中可使SUMO化速率提高高达36倍。
超越单步反应，MLOs为优化多酶通路提供了模块化策略。通过将多个酶聚集在单个凝聚体中，MLOs减少了不稳定中间体的损失，抑制了副反应，并限制了有毒副产物的积累。例如，在谷氨酸棒杆菌中利用合成无序蛋白（SIDPs）构建的生物分子凝聚体招募2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）生物合成关键酶，产量达到681.6 mg/L。
细胞内过程控制与探测
合成生物分子凝聚体已成为通过空间区室化特定分子和生化反应来控制细胞活动的强大工具。例如，Garabedian等人开发了一种使用三价RGG结构域支架的凝聚体平台，通过掺入高亲和力二聚化标签，该系统能够高效地将内源性靶蛋白招募到凝聚体中，有效调控细胞极性建立、细胞增殖和细胞骨架组织等关键细胞过程。
LLPS还被用于提高基因转录效率和翻译特异性。通过将FET家族（如FUS和TAF15）衍生的IDPs融合到CRISPR-SunTag系统中的转录激活结构域，研究人员在特定基因组位点工程化了相分离凝聚体，有效招募关键转录机制组件，从而显著改善转录延伸和内源性基因激活。
重组蛋白表达与纯化
LLPS驱动的MLOs已成为解决重组蛋白表达挑战的强大策略。MLOs通过LLPS形成的保护性微环境可以显著减少早期蛋白质聚集并防止不利的化学修饰。例如，Gabryelczyk等人开发的基于LLPS的融合标签BEAK-tag能够在大肠杆菌中高效表达淀粉样蛋白肽。
LLPS还为重组蛋白纯化提供了简单且经济高效的替代方案。基于LLPS的纯化利用可逆相变来浓缩和分离蛋白质，而无需依赖色谱步骤。例如，弹性蛋白样多肽（ELPs）在温度或盐浓度变化触发下发生相分离，实现高效的蛋白质富集。
功能生物材料工程
LLPS已成为工程化具有层次结构、动态功能和仿生特性的功能生物材料的通用分子自组装策略。LLPS介导的蛋白质凝聚体可以稳定无定形生物矿物前体，当与胶原蛋白或纳米纤维素等结构基质整合时，引导有序结晶。
LLPS在制造高性能蛋白质纤维中也起着关键作用。蜘蛛和蚕丝蛋白作为浓缩液体凝聚体储存在特殊腺体中；环境触发因素如pH梯度、离液盐或机械剪切诱导液-固转变（LSTs），产生具有特殊机械性能的半结晶纤维。
生物分子胞质递送
合成MLOs凭借其独特的物理化学性质和通过相分离产生的动态微环境，已成为有前景的递送平台。这些凝聚体可以保护治疗剂免于降解，并实现刺激响应性释放谱。与传统的化学合成聚合物载体相比，基于蛋白质的LLPS系统具有优异的生物相容性和安全性。
LLPS基于递送系统还可以克服传统载体通常依赖单药加载的限制，实现多种生物大分子的同时递送。例如，最近的研究开发了一种氧化还原响应性相分离肽（HBpep-SP），能够形成合成MLOs，有效递送所有三种主要的CRISPR/Cas9基因编辑格式：质粒DNA（pDNA）、信使RNA（mRNA）和Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）。
