J. Łapczuk-Romańska|J. Hybiak|K. Piotrowska|M. Marchelek-Myśliwiec|A. Wilk|M. Słojewski|E. Urasińska|M. Droździk
波兰什切青波美拉尼亚医科大学实验与临床药理学系
摘要
肾脏中的药物转运蛋白主要位于近端小管细胞的基底侧和顶侧膜上，在药物的分泌和重吸收过程中起着关键作用。最近的研究表明，肾脏疾病可以改变这些转运蛋白的表达；然而，在人类移植肾脏中（无论是否发生排斥反应），这些转运蛋白的表达情况仍不清楚。因此，本研究的目的是通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫组化技术，检测正常肾脏（CTRL，n=8）、未发生排斥反应的移植肾脏（AR-0，n=7）以及发生排斥反应的移植肾脏（AR-I，n=8）中肾小球和近端小管细胞中关键的ABC（ATP结合盒）转运蛋白（n=14种）和SLC（溶质载体）转运蛋白（n=33种）的mRNA表达情况。研究结果显示，与对照组相比，发生排斥反应的移植肾脏中的SLC22A4、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC28A1、SLC47A1、SLC22A11、SLC15A2、SLC16A1、ABCC2、ABCC5和ABCC6的mRNA表达水平显著下调，而SLC22A2、SLCO4A1和ABCB1的表达水平则显著上调。免疫组化结果显示，OAT1、OAT3、OCT2、MATE1、MRP2、MRP6和P-gp主要在近端小管细胞中表达，在AR-I和AR-0的活检样本中，这些转运蛋白的蛋白质表达量显著低于对照组。这些初步数据表明，接受免疫抑制药物治疗的患者的移植肾脏中，肾脏转运蛋白的表达谱可能发生了改变。
引言
肾脏在尿液中排泄内源性和外源性化合物（包括药物和毒素）以及维持机体稳态方面起着重要作用。肾脏对药物的清除作用是通过肾小球滤过、主动管状分泌和重吸收来实现的。药物在肾单位内的分泌和重吸收过程由转运蛋白调控，这些转运蛋白主要位于肾小管上皮细胞的基底侧和顶侧膜上（Morrissey等，2013；Miners等，2017）。药物转运蛋白分为两大类：ATP结合盒转运蛋白（ABC转运蛋白）和溶质载体（SLC转运蛋白）（Giacomini等，2010）。ABC蛋白是研究最为深入的药物转运蛋白，在肾脏中，最重要的包括多药耐药蛋白1（MDR1、P-糖蛋白[P-gp]、ABCB1）、多药耐药相关蛋白1（MRP1、ABCC1）、2（MRP2、ABCC2）、4（MRP4、ABCC4）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP、ABCG2）。这些蛋白的共同特征是利用ATP水解产生的能量来转运阳离子、疏水性和两性物质，包括免疫抑制剂、抗癌药物和大环内酯类等药物。ABC蛋白可以是位于小管细胞顶侧膜的外排转运蛋白，促进药物进入尿液；也可以是位于基底侧膜的转运蛋白，促进化合物从尿液中重吸收；此外，它们还可以限制药物进入近端小管细胞。SLC转运蛋白根据其膜定位和底物浓度梯度参与药物的细胞摄取和外排。最重要的肾脏摄取转运蛋白如有机阴离子转运蛋白1–3（OAT1-OAT3、SLC22A6-SLC22A8）、有机阳离子转运蛋白2和3（OCT2和OCT3；SLC22A2和SLC22A3）以及有机阴离子转运多肽4A1、4C1（OATP4A1、OATP4C1；SLCO4A1、SLCO4C1）位于基底侧膜。相反，主要的外排转运蛋白如多药和毒素外排蛋白1和2（MATE1和MATE2-K、SLC47A1和SLC47A2）、尿酸转运蛋白1（URAT1、SLC22A12）以及有机阳离子/肉碱转运蛋白1和2（OCTN1和OCTN2、SLC22A4和SLC22A5）则位于近端小管的顶侧膜（Li等，2006；Morrissey等，2013；Radi，2020）。
ABC和SLC转运蛋白的结构和功能研究表明，这些蛋白协同作用，共同参与肾脏对营养物质、毒素、外源物质（包括药物及其代谢物）的排泄。例如，基底侧的OAT1和OAT3转运蛋白促进底物（如替诺福韦，一种核苷酸类抗病毒药物）进入近端上皮细胞，而顶侧表达的MRP4则促进其进入尿液（Moss等，2014）。
ABC和SLC转运蛋白的表达和活性变化会改变肾脏排泄药物的药代动力学。例如，抑制或下调OCT2、OAT1等摄取转运蛋白的活性可以减少药物在肾小管中的肾毒性暴露。然而，这也会降低治疗药物的肾脏清除率，从而可能影响其药代动力学和药效学。转运蛋白的活性和表达水平可能因组织损伤、疾病状态、肾毒性药物以及其他内源性和外源性毒素而发生变化（Huo和Liu，2018；Evers等，2018）。
目前对人类肾脏中药物转运蛋白的认识主要基于整个肾脏皮层的表达数据，而不是其特定结构成分（如肾小球和近端小管）的数据（Nishimura和Naito，2005；Prasad等，2016；Oswald等，2019）。尽管在健康肾脏中已经对药物转运蛋白的特性进行了广泛研究，但初步研究表明，在病理条件下它们的表达会发生变化（Al-Majdoub等，2020；Zou等，2021）。迄今为止，关于人类肾脏疾病如何影响肾脏药物转运蛋白的表达和功能的资料仍然有限。慢性疾病（如糖尿病、高血压、肾小球肾炎和急性肾损伤）会导致肾功能逐渐丧失，最终可能需要透析和/或肾脏移植。实验研究表明，移植肾脏中的转运蛋白表达谱与健康肾脏有显著差异，这可能显著影响药物的药代动力学（Ciarimboli等，2013）。初步观察表明，免疫抑制药物可能会影响药物转运蛋白的表达水平，因为接受环孢素A或他克莫司治疗的患者的肾脏样本中P-gp的表达情况不同（Yu等，2008）。
因此，本研究的目的是分析和比较人类移植肾脏（无论是否发生急性排斥反应）以及健康肾脏中肾小球和近端小管细胞中重要ABC和SLC转运蛋白的基因表达情况。此外，还进行了免疫组化分析，以确认mRNA水平上的显著差异，并确定高表达药物转运蛋白的细胞定位。
研究样本
肾脏样本
对照组样本来自波兰什切青波美拉尼亚医科大学泌尿科接受手术切除肾脏的患者（n=8），这些患者患有肾细胞癌（6名男性和2名女性；中位年龄分别为61岁和48岁，见表1）。患者没有其他慢性疾病。肾切除后立即收集距离肿瘤至少5厘米处的非肿瘤性肾脏皮质组织，并用4%的福尔马林固定。肾脏近端小管中ABC和SLC转运蛋白的mRNA表达
在分析的14种ABC转运蛋白中，ABCB5、ABCB11、ABCG5和ABCG8在所有研究组的近端小管中均未检测到（平均Ct值>35）。在定量检测的基因中，ABCC6的表达水平最高，而ABCG2的mRNA表达水平最低（图2）。在发生排斥反应的移植肾脏（AR-1组）和健康肾脏的近端小管中，ABCC2、ABCC5和ABCC6的基因表达存在统计学上的显著差异。
讨论
肾脏作为药物、其代谢物和内源性分子的主要排泄器官，起着至关重要的作用。肾脏过滤或分泌功能的任何障碍都可能显著影响肾脏对药物的清除和这些物质的暴露。在本研究中，我们比较分析了健康肾脏以及未发生排斥反应和发生排斥反应的肾脏中肾小球和近端小管细胞中ABC和SLC转运蛋白的表达情况。
作者贡献声明
J. Łapczuk-Romańska：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、实验设计、概念构思。J. Hybiak：方法学设计。K. Piotrowska：数据可视化、方法学设计、数据分析。M. Marchelek-Myśliwiec：资源准备。A. Wilk：资源准备。M. Słojewski：资源准备。E. Urasińska：资源准备。M. Droździk：撰写 – 审稿与编辑、监督、概念构思。资助声明
本研究得到了什切青波美拉尼亚医科大学的资助（MB-127-233/18）。未引用的参考文献
Bajaj等，2018年；Basit等，2019年；International Transporter Consortium等，2010年；Nagasawa等，2002年；Nakamura等，2020年；Nieskens和Wilmer，2016年；Paalzow和Gabrielsson，1990年；Perry等，2021年；Pizzagalli等，2002年；Radchenko和Wagner，2020年；Santos Pereira等，2014年；Schaeffeler等，2001年；Schnell等，2019年；Schröder等，2002年；Schröder等，2002年；Schwarz等，2001年；Shin等，2007年；Shu等，2007年；Smith等，2013年；Tzvetkov等，2009年；Ueo等，2005年；Yee等，2019年；Zamek-Gliszczynski等，2018年。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
