ABSTRACT
猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）是猪地方性肺炎的主要病原体，对养猪业构成重大威胁，挑战食品安全和畜牧业的可持续发展。本研究通过筛选多种天然化合物，鉴定出四种原小檗碱生物碱——表小檗碱（epiberberine）、药根碱（jatrorrhizine）、小檗碱（berberine）和黄连碱（coptisine），并评估了它们的抗Mhp活性。所有生物碱均对强毒力Mhp菌株ES-2表现出强大的抑制作用，最小抑菌浓度（MIC）在8至32 µg/mL之间。其杀菌活性具有时间和浓度依赖性。在细胞水平上，所有原小檗碱生物碱均显著增强感染细胞的活力，抑制促炎细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-1β）的表达，并对宿主细胞表现出低细胞毒性。在长白二元杂交猪感染模型中，药根碱显著减轻了临床症状，降低了肺部病原体载量，并减轻了肺组织的组织病理学损伤，其治疗效果与氟苯尼考（florfenicol）相当。我们的研究结果表明，原小檗碱生物碱具有强大的抗Mhp活性、高安全性和良好的治疗潜力。
IMPORTANCE
由猪肺炎支原体引起的猪地方性肺炎仍然是全球养猪业中经济破坏性最大的呼吸道疾病之一。畜禽中抗生素耐药性的出现凸显了对有效、安全且可持续的替代品的迫切需求。本研究表明，天然来源的原小檗碱生物碱对猪肺炎支原体表现出强大的抗菌活性，同时保持低宿主细胞毒性和强大的抗炎作用。其中，药根碱在感染猪中显示出显著的治疗效果，与氟苯尼考相当。这些发现为开发原小檗碱生物碱作为控制猪肺炎支原体感染的传统抗生素的有前景的天然替代品提供了科学依据，从而有助于改善动物健康、减少抗菌素耐药性并促进可持续的生猪生产。
INTRODUCTION
养猪业是畜牧业的重要组成部分。在中国，猪肉不仅是人类饮食中动物蛋白的主要来源，也是国家食品安全和社会稳定的基石。根据联合国粮食及农业组织（FAO）的数据，到2023年，中国猪肉产量达到5794万吨，占全国肉类产量的60%。猪肉消费在中国人口的饮食结构中占据中心地位，人均消费量最高。因此，维持健康稳定的生猪生产体系对于保障猪肉供应和促进农业可持续发展至关重要。然而，随着集约化养殖的扩大，猪群日益受到各种传染病的威胁。由细菌病原体引起的呼吸系统和全身性疾病是影响猪健康和生产效率的主要因素。在这些病原体中，猪肺炎支原体（Mhp）是地方性肺炎的主要病原体，全球流行，并且是猪呼吸道疾病综合征（PRDC）中的核心病原体。据报道，全球家猪群中Mhp的平均流行率为30%–80%。一些研究表明，Mhp感染可使生长速度降低6%–16%，降低饲料转化率，延长育肥周期，严重时增加死亡率。此外，Mhp感染增加了对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流感病毒和胸膜肺炎放线杆菌的易感性，加重了肺部病理变化和经济损失。另外，慢性Mhp感染损害肌肉发育和肉质，降低胴体等级和经济价值。鉴于Mhp的显著影响，制定有效的预防和控制策略已成为猪健康研究的焦点。
目前，Mhp感染的控制依赖于疫苗接种、环境管理和药物干预相结合。其中，疫苗接种在大型养猪场广泛实施，以减轻临床症状、肺部病变和继发感染的发生率。研究表明，商业化的灭活疫苗可以在一定程度上增强宿主的免疫防御。然而，由于病原体的高抗原变异性以及疫苗诱导粘膜免疫的能力有限，保护效果仍不理想。此外，需要早期断奶后免疫，不当的管理或仔猪免疫状态不一致可能导致疫苗失败。考虑到疫苗的有限效力，抗生素治疗仍然是临床管理Mhp感染的关键方法。常用的抗生素包括大环内酯类（如替米考星、泰乐菌素）、林可酰胺类（如林可霉素、克林霉素）、四环素类和氟喹诺酮类。其中，替米考星和氟苯尼考（FFC）因其高组织渗透性和在肺组织中的积累而经常被使用。这些抗生素通常通过饲料或饮水给药，便于群体给药。然而，抗生素的广泛且往往不合理的使用引起了严重关切。作为一种缺乏细胞壁的革兰氏阴性样微生物，Mhp对β-内酰胺类抗生素具有天然耐药性，并且近年来报道了对传统有效抗生素的耐药性增加。一些研究记录了临床分离株中对泰乐菌素、林可霉素、多西环素等常用药物的最小抑菌浓度（MIC）不断增加。鉴于Mhp可能作为耐药基因的储存库，存在水平基因转移至其他细菌的潜力，构成公共卫生威胁。因此，迫切需要开发针对Mhp的新型有效抗菌药物。
近年来，天然产物，特别是从中药中提取的单体化合物，因其独特的结构、多样的生物活性和丰富的来源，作为新型抗生素开发的有前景候选物而受到关注。然而，与金黄色葡萄球菌或大肠杆菌等模式病原体相比，关于天然产物抗Mhp潜力的研究仍然有限。鉴于Mhp独特的生物学特性，包括其缺乏细胞壁、代谢依赖性和独特的药物靶点，其敏感性谱可能与其他细菌不同，这凸显了对天然化合物进行针对性筛选和评估的必要性。本研究选用了强毒力、耐药的Mhp ES-2分离株（中国湖北，2017年），该菌株具有典型的支原体形态，并能在猪中引起可复制的肺炎。基于已知的安全性和药理活性，共筛选了20种结构多样的天然化合物，包括黄酮类、生物碱类和酚类。在这些化合物中，原小檗碱生物碱，包括表小檗碱、药根碱、小檗碱和黄连碱，因其对Mhp的抗菌活性而被选择进行进一步研究。先前的研究表明，小檗碱可以抑制禽滑液支原体在巨噬细胞中的生长和粘附，并减弱PI3K/Akt依赖的炎症和凋亡反应，表明其在支原体感染中的治疗潜力。此外，一些含有小檗碱或苦参碱的传统中药配方（如麻杏石甘汤和党参玉屏风汤）已被报道可改善儿童或犊牛感染肺炎支原体的临床或实验结果。然而，这些效果很大程度上归因于对宿主免疫反应的调节，关于单个单体化合物抗支原体活性的直接证据仍然有限。除了小檗碱，其他原小檗碱生物碱如表小檗碱、药根碱和黄连碱也表现出多种抗菌和抗炎活性。尽管如此，先前的研究主要集中在非支原体病原体或非呼吸系统疾病，这些生物碱是否对Mhp具有活性仍知之甚少。迄今为止，尚无系统研究比较多种原小檗碱单体对Mhp的效力，也未评估其体内表现。因此，本研究系统评估了四种原小檗碱生物碱的抗Mhp活性，并进行了细胞实验和动物感染实验以探索其转化潜力。特别强调了药根碱作为关键候选物，旨在确定它是否可以作为治疗猪支原体病的有前景的治疗分子，从而为原小檗碱生物碱在控制Mhp感染中的应用提供实验证据。
RESULTS
原小檗碱生物碱对Mhp表现出抑制潜力
为了鉴定对Mhp菌株ES-2具有显著体外抗菌活性的天然化合物，我们筛选了20种结构多样、安全性明确且具有药理活性的天然产物。这些化合物根据其结构多样性和天然来源进行选择。基于至少三次独立重复实验中培养物颜色变化（变黄）的肉眼观察，包括表小檗碱（Epi）、药根碱（Jatr）、小檗碱（BBR）和黄连碱（Copt）在内的几个处理组未显示颜色变化，表明对Mhp生长有潜在抑制作用。相比之下，其他几个组显示出与阳性对照相似的颜色变化，表明缺乏明显的抗菌活性。为了定量评估每种化合物的抗菌效果，从每个处理组提取Mhp基因组DNA，并使用常规定量聚合酶链反应（qPCR）检测Mhp特异性基因P36。Ct值的变化用于评估目标DNA的丰度，Ct值增加表明细菌DNA载量减少，从而抗菌效果更强。与阳性对照（Ct = 22.40）相比，Epi (32.83)、BBR (31.07)、小檗红碱 (31.68)、Copt (32.55)、Jatr (32.95) 和常春藤皂苷B (31.86) 的Ct值显著升高（P< 0.001），表明对Mhp生长有显著抑制。此外，雷公藤甲素和大黄素显示出中等抑制活性（P< 0.01）。其他化合物，包括黄酮类和酚类（如甘草苷、黄芩苷和阿魏酸），未显著改变Ct值，表明活性微弱或可忽略不计。基于qPCR筛选结果，选择了8个Ct值显著升高的化合物，使用微量肉汤稀释法进一步评估其MIC。其中，Epi和Jatr表现出最强的活性，MIC为8 µg/mL，其次是BBR和Copt（MIC = 16 µg/mL）。小檗红碱和雷公藤甲素显示出中等活性（MIC = 32 µg/mL），而酸藤子酚和常春藤皂苷B效果最差（MIC分别为128和256 µg/mL）。作为阳性对照，FFC表现出最低的MIC（0.5 µg/mL）；然而，由于其副作用和耐药性问题，更安全的天然化合物对于治疗开发仍然具有意义。最终，选择了四种最有效的化合物Epi、Jatr、BBR和Copt进行进一步的抗菌研究。化学结构显示它们都是原小檗碱生物碱，具有共同的多环芳香骨架和多个甲氧基或羟基取代基，表明这些结构特征可能对其抗菌活性至关重要。总之，我们成功地从一组结构多样的天然产物中鉴定出四种对Mhp ES-2具有强效体外活性的原小檗碱生物碱。
四种原小檗碱生物碱对Mhp表现出有效的杀菌活性
为了验证四种选定的原小檗碱生物碱对强毒力Mhp ES-2菌株的体外抗菌活性，测试了一系列浓度，并使用颜色变化单位（CCU）法连续监测细菌活力。FFC（0.5 µg/mL）和未处理的细菌对照用于比较。总体而言，所有四种生物碱在较高浓度（≥ 32 µg/mL）下均表现出显著的杀菌活性，在96–168小时内实现明显或完全的细菌清除。值得注意的是，在32 µg/mL浓度下，Epi和Jatr均在168小时内实现完全根除，具有高度相似的杀灭曲线，表明效力相当。在64 µg/mL浓度下，BBR显示出最快速的杀菌效果，细菌计数从96小时开始稳定下降，并在120小时内降至检测限以下，表明其作用更快。相比之下，Copt活性较弱，即使在64 µg/mL浓度下也未完全杀灭，表明效力较低。所有化合物均观察到明显的剂量反应关系；浓度增加导致细菌存活率降低，更高剂量导致更快速、更彻底的杀菌效果。尽管四种化合物在结构上与原小檗碱生物碱相似，但它们对Mhp的体外活性水平不同，暗示取代模式、空间构象和膜通透性的细微差异可能影响其抗菌性能。BBR的快速作用可能归因于其高亲脂性和高效的靶点结合能力。总之，所有四种原小檗碱生物碱在体外均能有效抑制Mhp ES-2的生长，具有强效的时间和浓度依赖性抗菌活性。BBR和Jatr被确定为最有效的处理。
四种原小檗碱生物碱之间的协同抗菌活性
为了进一步研究不同原小檗碱生物碱之间潜在的协同抗菌作用，进行了棋盘微量稀释试验以评估其体外联合抗菌活性。Epi与其他三种生物碱的组合表现出相加效应。具体而言，Epi与Jatr组合（Epi + Jatr）的分数抑菌浓度指数（FICI）为0.75，Epi与BBR组合（Epi + BBR）为1.0，Epi与Copt组合（Epi + Copt）为0.5625。BBR + Jatr组合也显示出相加效应，FICI为0.625。这些结果表明，这些组合的抗菌活性比单独使用化合物有所增强，但未观察到协同作用。然而，BBR + Copt和Copt + Jatr组合的FICI值为1.5，表明这些化合物对之间没有显著的相互作用。当与常规抗生素FFC组合时，所有测试的组合均显示FICI值 > 1.0，表明既无相加效应也无协同效应。总之，某些原小檗碱生物碱的组合，特别是Epi + Jatr、Epi + Copt和BBR + Jatr，显示出对Mhp潜在的相加抗菌作用，而与FFC共同处理并未增强抗菌效力。这些发现表明原小檗碱生物碱更适合作为独立的天然抗菌剂。
原小檗碱生物碱在哺乳动物细胞中的有限细胞毒性
天然生物碱作为新型抗菌候选物因其广泛的药理活性和天然来源而受到关注。然而，其安全性对其临床转化至关重要。本研究系统评估了四种原小檗碱生物碱在三种代表性猪源细胞模型中的细胞毒性：猪气管上皮细胞（STEC）、猪肾上皮细胞（PK-15）和猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）。在STEC细胞中，Epi和Jatr在4–128 µg/mL浓度范围内表现出可忽略的细胞毒性，细胞活力保持在 > 99%。类似地，BBR和Copt在8–256 µg/mL范围内无毒，细胞活力稳定在99%左右，表明在气道上皮细胞中具有高生物安全性。在3D4/21肺泡巨噬细胞中，Epi、Jatr和Copt在所有测试浓度下均显示最小的细胞毒性，细胞活力保持在99%。相比之下，BBR在浓度 > 128 µg/mL时表现出轻微的细胞毒性，活力降至95%，表明在较高剂量下需要谨慎。在PK-15细胞中，Epi和Jatr在浓度 ≤ 128 µg/mL时再次显示无检测到的细胞毒性。然而，BBR在浓度 > 128 µg/mL时表现出显著毒性，将细胞活力降至72%。Copt也诱导轻度毒性，将细胞活力降至93%。这些结果凸显了高浓度BBR和Copt的潜在肾毒性风险。相比之下，临床抗生素FFC在测试浓度范围内对所有三种细胞系均表现出最小的细胞毒性。总之，这些发现表明Epi和Jatr在猪呼吸道上皮和肾上皮细胞系中表现出良好的生物相容性，而BBR和Copt需要剂量优化以确保其安全性，特别是在肾脏来源的细胞中。
原小檗碱生物碱对Mhp感染细胞的保护作用
为了进一步评估四种原小檗碱生物碱对Mhp ES-2感染细胞的保护作用，选择了每种化合物的最高无毒浓度进行处理。总体而言，与Mhp感染组相比，原小檗碱生物碱在24和48小时显著提高了细胞活力，表明具有显著的细胞保护作用。特别是在48小时，所有处理组的细胞活力接近未感染和FFT处理的对照细胞水平。所有原小檗碱生物碱单独使用（无感染情况下）与未处理的对照细胞相比未引起显著细胞毒性（P> 0.05），再次确认了它们在实验浓度下的安全性。具体而言，Epi组显示细胞活力从12小时的75.99%显著增加到24小时的92.18%，并在48小时维持正常水平。类似地，Jatr组在24小时后从80.93%增加到92.29%。BBR组显示活力从72.12%（12小时）改善到90.92%（24小时），并在48小时维持正常水平。Copt处理的细胞活力也从12小时的80.7%增加到24小时的91.32%，在48小时与对照组无显著差异。这些结果证实所有四种化合物均能有效恢复Mhp感染细胞的活力，其中Epi和Jatr显示出特别强的保护作用。这表明它们的保护作用可能归因于抑制Mhp增殖或增强宿主细胞修复机制。
四种原小檗碱生物碱对Mhp感染细胞炎症细胞因子表达的调节作用
为了进一步阐明不同生物碱对Mhp ES-2诱导的炎症介质表达的调节作用，在感染细胞中量化了三种代表性促炎细胞因子（包括TNF-α、IL-6和IL-1β）的mRNA水平。结果显示，Mhp感染显著上调了所有三种细胞因子的转录，与正常对照组相比，IL-6和IL-1β的表达分别增加了近15倍和20倍。这表明Mhp感染强烈诱导了炎症介质的释放。相比之下，用所有四种生物碱处理均能不同程度地有效逆转感染诱导的炎症细胞因子的过度表达，其中Epi和Jatr显示出最显著的效果。值得注意的是，所有生物碱在未感染细胞中均不诱导细胞因子表达，表明它们自身不会引发炎症反应。在这些化合物中，Epi发挥了最强的抑制作用，显著抑制TNF-α和IL-1β的表达至与阳性对照药FFC相当的水平，并恢复至基线水平。尽管Epi未完全使IL-6表达正常化，但其水平较感染组显著降低。Jatr也显著抑制TNF-α表达至正常水平，并有效下调IL-6和IL-1β，显示出广谱抗炎活性。BBR对TNF-α表现出特别强的抑制作用，并且与Jatr类似，显著下调IL-1β和IL-6，尽管未达到正常水平。Copt显著抑制IL-6和IL-1β表达，但对TNF-α影响最小。这些发现证明所有四种原小檗碱生物碱均具有不同程度的抗炎活性。特别是，Epi和Jatr在抑制多种关键炎症细胞因子和减轻Mhp感染细胞引发的炎症方面非常有效，从而突出了它们作为治疗Mhp相关感染的免疫调节剂的潜力。
药根碱对猪支原体肺炎表现出优异的治疗效果
基于全面的体外抗菌活性、细胞毒性筛选和药物成本效益考虑，选择Jatr作为最有前景的化合物，在猪Mhp ES-2感染模型中进行体内验证。与未感染的空白对照组（0.17 kg）相比，未处理的感染组的平均日增重（ADG）降至0.10 kg，显著降低。相比之下，Jatr和FFC处理组的ADG分别为0.17和0.18 kg，均显著高于感染组，并且与健康对照组在统计学上无差异。这表明两种治疗均有效恢复了生长性能。在体温方面，未感染的空白对照组猪只维持正常范围（38.6°C–39.0°C）。感染后，未处理的猪只表现出体温波动，范围在38.6°C至39.6°C之间。然而，Jatr和FFC处理的动物恢复到生理范围（分别为38.5°C–39.4°C和38.6°C–39.3°C），表明两种治疗均能有效解决感染引起的发热。随后，采集心脏、肝脏、肺、肾脏、气管和肺门淋巴结的组织样本，进行qPCR分析以检测病原体。在未处理组中，所有肺样本Mhp检测呈阳性（感染率100%），33.33%的脾脏和气管组织也显示存在病原体。在Jatr处理组、FFC处理组和未感染空白对照组的所有组织中均未检测到Mhp DNA，证明两种治疗均成功清除了宿主组织中的病原体。此外，评估了脾脏、肺和肺门淋巴结中TNF-α、IL-6和IL-1β的相对表达。与未处理组（显示细胞因子水平显著升高）相比，Jatr处理组在所有三种炎症标志物上均表现出显著降低。进行大体和组织病理学检查以评估肺组织保护情况。大体上，未处理的感染肺显示显著病变，特别是在尖叶和心叶
