引言
抗菌药物耐药性（AMR）的蔓延已成为全球公共卫生危机，其中碳青霉烯类耐药肠杆菌目（CRE）因治疗选择有限和高死亡率构成严重威胁。肺炎克雷伯菌作为医疗相关感染的主要病原体，其碳青霉烯类耐药克隆（CRKP）的全球传播尤为突出。ST37型作为新兴的CRKP流行克隆，近期研究显示其与KPC-2型碳青霉烯酶的关联日益密切，但该克隆的毒力特征尚未明确。传统多重耐药（MDR）肺炎克雷伯菌通常毒力较低，而高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）多表现为社区获得性感染且对抗菌药物敏感。然而，近年来出现的同时具备高毒力与碳青霉烯类耐药的菌株（hv-CRKP/CR-hvKP）标志着耐药性与毒力的收敛进化，可能引发更严峻的临床挑战。毒力因子如荚膜、脂多糖（LPS）、铁载体和菌毛在肺炎克雷伯菌的致病过程中起关键作用，其中铁载体介导的铁获取能力是病原体在宿主铁限制环境中存活与增殖的核心机制。气杆菌素（aerobactin）作为高亲和力铁载体，是hvKP的关键毒力决定簇，其阳性菌株常与更严重的感染相关。
材料与方法
研究收集了2020年12月至2023年8月期间宁波大学第一附属医院临床标本中分离的15株非重复CRKP菌株。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定，并以hvKP标准株NTUH-K2044（ST23）和经典肺炎克雷伯菌（cKP）HS11286（ST11）分别作为毒力阳性和阴性对照。采用VITEK®2系统测定最小抑菌浓度（MICs），依据美国临床和实验室标准协会（CLSI）指南进行药敏试验。全基因组测序（WGS）通过Illumina NovaSeq 6000平台完成，利用MLST、ResFinder、Kleborate和PlasmidFinder等工具进行多位点序列分型（MLST）、耐药基因、毒力因子、荚膜血清型和质粒复制子分析。此外，从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中筛选出1,236株ST37基因组序列，结合本研究15株菌株构建系统发育树。表型毒力实验包括铬天青S（CAS）法定量铁载体产生、拉丝试验评估高粘液性、离心法半定量粘稠度测定、荚膜多糖尿酸含量检测、血清抗性试验以及大蜡螟幼虫感染模型。
结果
ST37型肺炎克雷伯菌的鉴定与核心基因组分析
15株菌株均经MLST确认为ST37型，主要分离自中老年患者的痰液（33.3%）和尿液（26.7%）标本。系统发育分析显示，全球1,251株ST37菌株可分为15个进化枝，本研究菌株集中于枝1、枝2和枝3。值得注意的是，全球ST37菌株中7.6%（95株）携带KPC-2基因，包括本研究的9株菌。依据SNP差异≤20的标准，YF2203、YF2197、YF1072和YF1062被判定为近期克隆传播株。
抗菌药物耐药谱
所有菌株均对碳青霉烯类耐药，且对头孢呋辛、头孢西丁、头孢曲松、阿莫西林/克拉维酸和哌拉西林/他唑巴坦完全耐药（100%）。其中93.3%的菌株对厄他培南、亚胺培南和头孢哌酮/舒巴坦耐药，80.0%对头孢他啶和左氧氟沙星耐药，73.3%对头孢吡肟耐药。替加环素和阿米卡星的耐药率分别为20.0%和6.7%。
耐药与毒力基因及质粒的分子特征
9株菌（60.0%）携带blaKPC-2基因，其他β-内酰胺酶基因包括blaSHV-110（86.7%）、blaTEM-1D（53.3%）及多种blaCTX-M型别。未检测到金属β-内酰胺酶（MBL）基因。毒力基因分析显示，YF1062、YF1072、YF2197和YF2203四株菌携带完整的气杆菌素基因簇（iucABCD/iutA）和耶尔森菌素（yersiniabactin）相关基因。荚膜血清型以KL12（33.3%）和KL25为主，LPS O抗原以OL103（33.3%）和O5为主。质粒分型显示IncFIB(K)（80.0%）和repB(R1701)（53.3%）为优势复制子。值得注意的是，4株高毒力菌均携带位于IncFIB(K)质粒上的iuc3谱系基因，且与blaKPC-2共存于可移动遗传元件。
高毒力ST37 CRKP的病原学分析
CAS法显示气杆菌素阳性菌株的铁载体产量与hvKP对照株NTUH-K2044相当，而仅携带耶尔森菌素基因的菌株呈中等产量，缺乏铁载体基因簇的菌株产量最低。拉丝试验中仅YF2189表现为高粘液表型，其粘稠度测量值也显著高于其他菌株。荚膜多糖定量显示YF2227的尿酸产量最高，与NTUH-K2044持平。血清抗性试验表明YF1101、YF2177、YF2180和YF2228的存活率与阳性对照相近。大蜡螟感染模型证实，气杆菌素阳性菌株在104CFU/幼虫和105CFU/幼虫接种量下均导致幼虫存活率急剧下降，YF1062和YF2203分别在12小时和72小时内使存活率降至≤10%和0%，显著高于其他菌株。
讨论
本研究首次揭示了ST37 CRKP克隆中高毒力菌株的涌现，其特征为气杆菌素基因簇携带、高水平铁载体产生以及大蜡螟模型中的极端致死性。这些菌株同时具备KL25/O5血清型特征和KPC-2介导的碳青霉烯类耐药性，标志着ST37 lineage已从单纯耐药病原体演变为兼具高毒力的"双高"威胁。气杆菌素系统在驱动高毒力表型中的主导作用得到验证，而耶尔森菌素基因的单独存在不足以引发同等毒力。尽管高粘液表型与毒力的关联存在争议，本研究中毒力最强的菌株并未表现高粘液性，提示ST37 CRKP的毒力机制可能存在异质性。质粒分析表明气杆菌素与KPC-2基因可能通过可移动元件共同传播，增加了临床干预的复杂性。该收敛进化现象对公共卫生监测提出紧迫需求，需建立针对毒力基因的CRKP筛查策略，并研发同时靶向耐药与毒力通路的新型疗法。
结论
ST37 CRKP中高毒力菌株的出现证实了耐药性与毒力在该克隆中的收敛进化。KL25/O5血清型与气杆菌素阳性表型的关联为监测提供了潜在标志物。此类菌株的传播可能进一步限制临床治疗选择，亟需通过多组学监测与创新疗法应对这一新兴威胁。
