当全球仍处于COVID-19疫情的余波中，科学家们深刻认识到新发传染病的威胁无处不在。从导致马铃薯晚疫病的致病疫霉，到引发橄榄快速衰退综合征的苛养木杆菌，再到造成小麦赤霉病的禾谷镰刀菌，病原体不仅威胁粮食安全，更通过全球化贸易网络快速扩散。传统病原体检测方法如形态学观察、微生物分离培养等存在明显局限：检测范围窄、耗时长且灵敏度不足。即便分子生物学技术如实时荧光定量PCR（qPCR）加快了检测速度，其有限的检测范围仍难以应对混合感染或罕见病原体的挑战。
在此背景下，高通量测序技术应运而生，成为病原体检测领域的革命性工具。其中，基于多重PCR的靶向测序以其成本效益和高效率备受关注，但引物设计中的二聚体形成和偏好性等问题限制了其应用效果。发表于《aBIOTECH》的这篇综述系统梳理了测序技术在病原体检测中的最新进展，重点探讨了如何通过创新性引物设计策略突破现有技术瓶颈。
研究人员主要运用了四种关键技术方法：首先通过培养组学（culturomics）结合MALDI-TOF质谱和16S rRNA基因测序进行微生物分离鉴定；其次采用宏基因组学（metagenomics）和宏转录组学（metatranscriptomics）对临床和环境样本进行无偏倚测序；第三重点优化了多重PCR靶向测序中的引物设计流程；最后整合人工智能算法提升检测精度和效率。样本来源涵盖人类临床标本、畜禽肠道微生物组以及植物根际土壤等生态环境。
2. 通过培养组学探索新型病原体谱系
研究表明人类肠道中约62%的细菌谱系属于新发现类型，其中80%原本被认为不可培养。培养组学通过多样化培养条件成功分离出与早产儿坏死性小肠结肠炎相关的丁酸梭菌等病原体，在动物和植物微生物研究中也揭示了微生物多样性对健康与疾病的关键作用。
3. 宏基因组和宏转录组学方法在病原体检测中的应用
mNGS（宏基因组下一代测序）技术能够无偏倚地检测细菌、病毒、真菌和寄生虫等多种病原体，在新生儿肺炎、败血症等临床案例中成功鉴定出90%的致死病原体。大规模病毒组研究通过分析1941只野生动物，发现了102种哺乳动物感染病毒，包括13个病毒科的65种新病毒。
4. 通过靶向测序进行微生物鉴定和监测
与全基因组测序相比，靶向测序成本更低、速度更快。多重PCR靶向测序在COVID-19疫情期间被广泛应用于SARS-CoV-2谱系变异分析、病毒丰度监测和感染源追踪，在呼吸道病原体检测成本仅为宏基因组测序的四分之一。
5. 多重PCR靶向测序的挑战与策略
引物设计成为关键技术瓶颈。研究对比了三种引物设计策略：逐条序列设计法耗时费力；K-mer创建法能提高靶标覆盖度；多序列比对法则通过保守区域设计简并引物。其中简并引物能提供更广的靶标覆盖范围并简化设计流程。
6. 容错策略：改进PCR靶向测序
创新性提出"容错模式"，允许引物与模板之间存在特定数量的错配碱基。研究表明，通过合理设置错配数量和位置（如避免3'末端错配），仅需两个简并度为4的引物即可实现100%覆盖度，同时维持引物特异性和灵敏度。
7. 容错性简并引物设计的挑战
引物设计属于NP完全问题，现有工具如HYDEN、Primux等存在计算耗时、无法精确控制错配位置等问题。MultiPrime工具虽能根据用户需求设计引物，但仍缺乏对容错性引物效率和安全性的全面评估体系。
8. 人工智能在测序技术中的应用：革命性改变病原体检测和引物设计
AI技术通过处理宿主主导的核酸信号，显著提高了低丰度病原体的检测灵敏度。在兽医诊断中，AI优化纳米孔测序技术能高效检测非洲猪瘟病毒等重大动物病原体；在农业领域，AI驱动的16S rDNA测序提升了植物病原体鉴定精度，支持作物病害早期预警。
研究结论强调，面对病原体多样性带来的诊断挑战，需要整合多种技术策略。对于已知病原体检测，推荐采用靶向测序策略结合MultiPrime等引物设计工具；对于新病原体发现，则需要采用无参考基因组的宏基因组学方法。通过人工智能技术与测序平台的深度整合，将显著提升病原体检测的准确性、速度和可及性，为构建可持续的"One Health"健康体系提供关键技术支撑。该研究不仅推动了病原体检测技术的发展，更为全球疾病防控、食品安全保障和生态环境保护提供了创新解决方案。
