通过整合转录组学和数据独立的方法，分析了Monascus菌中azaphilone色素及citrinin的生物合成过程

红曲菌M3、M34、M69菌株通过比较基因组、转录组和DIA-MS蛋白质组学分析，发现差异基因与蛋白（DEG/DAPs）与色素（MPs）和毒素（CIT）产量相关，为工业菌株选育提供依据。

黄颖颖|邵彦春|杨成龙|莫尔纳尔·伊斯特万

福建省农业科学院食品科学与技术研究所，福州350003，中国

摘要

Monascus产生的阿扎菲隆色素（MPs）是广泛使用的功能性食品添加剂。然而，Monascus同时可能产生霉菌毒素柠檬霉素（CIT），这会威胁MPs的安全性。在此研究中，我们利用比较基因组学、转录组学以及数据独立获取质谱（DIA-MS）蛋白组学分析方法，对比了三种代表性的Monascus purpureus菌株：M3（MPs和CIT含量均高）、M34（MPs含量高但CIT含量低）以及M69（两种物质的含量均低）。比较基因组学分析证实这些菌株之间存在高度相似性。通过菌株间的成对比较，我们识别出了差异表达基因（DEGs）和差异丰度蛋白质（DAPs），并通过逆转录定量聚合酶链反应和并行反应监测技术验证了这些基因和蛋白质。综合分析揭示了与MPs和CIT生成变化相关的DEGs/DAPs，为通过菌株育种来开发更安全、更高效的MPs生产过程提供了依据。

引言

丝状真菌Monascus属常用于生产各种传统发酵食品，如米酒和豆腐乳。Monascus的代谢产物，如阿扎菲隆色素（MPs）、单克隆醇型羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂和γ-氨基丁酸，也具有很高的商业价值，可用作食品着色剂、化妆品成分及潜在的治疗剂（Huang等人，2023；Huang等人，2021；Lin等人，2021）。其中，MPs作为天然食品级着色剂和调味剂，具有有益的健康效果。然而，Monascus菌株在产生MPs的同时通常也会产生霉菌毒素柠檬霉素（CIT），这影响了MPs的安全性，并严重限制了其应用。因此，开发高效Monascus菌株和发酵工艺以提高MPs产量并减少或消除CIT积累一直是发酵工业长期的研究目标。

基因组学技术促进了Monascus物种的进化分析、主要代谢途径的研究，以及其次级代谢产物生物合成基因簇（BGCs）的预测和功能研究（Dai等人，2021；Xu等人，2021；Pavesi等人，2021）。Liu等人报告称，某些次级代谢产物BGCs在Monascus属中具有高度保守性，这些产物可能在自然环境中的生态位竞争中带来适应性优势（Liu等人，2022）。MPs和CIT的生物合成机制已被阐明，涉及聚酮合酶（PKS）和脂肪酸合成酶在聚酮骨架的构建中的作用。这些核心生物合成酶的基因定义了Monascus基因组中的独立MPs和CIT BGCs，同时还编码额外的修饰酶和代谢物转运蛋白，并受到不同簇特异性调控因子的控制（Chen等人，2019；Chen等人，2017；He & Cox，2016；Li等人，2020；Li等人，2025）。

转录组学是研究Monascus代谢及其调控的最常用且最成功的组学技术。它揭示了Monascus培养过程中基因和BGC表达的时空差异，阐明了环境适应的代谢机制，并有助于新转录调控因子的预测和发现（Xie等人，2022；Tong等人，2022；Zhu等人，2024）。此前，我们利用转录组学技术识别了产生不同量CIT的M. purpureus菌株中的差异表达基因（DEGs）（Huang等人，2023）。鉴于Monascus次级代谢的调控机制非常复杂且尚未完全理解，蛋白组学主要致力于参与主要代谢途径的酶的鉴定和表征（Jiang等人，2024；Zhou等人，2020）。

多项研究通过单独的转录组学或蛋白组学分析，比较了不同菌株或不同发酵条件（如不同的碳/氮源、特殊添加剂、光照处理等）对Monascus基因转录或蛋白质积累的影响（Liang等人，2018；Ouyang等人，2021；Qiao等人，2022；Hong等人，2020；Tan等人，2014）。然而，由于转录后、翻译后和翻译后调控的作用，基因表达水平与蛋白质积累往往不完全对应。最近，多组学技术和生物信息学技术的结合有助于发现新的调控因子，并探索Monascus次级代谢的调控机制（Li等人，2022；Huang等人，2023；Huang等人，2021）。因此，将转录组学与蛋白组学及其他组学技术相结合，可能是揭示次级代谢产物生产限制的有效方法，从而更准确地了解代谢资源在不同生物合成途径中的动态分配。然而，仅有少数研究结合了比较转录组学和蛋白组学分析来研究Monascus中MPs和CIT生成的动态及调控机制（Huang等人，2018）。

大多数先前的Monascus样本蛋白组学分析采用传统的依赖数据获取（DDA）模式，导致在比较多个样本时低丰度肽类表达不足且存在数据缺失。相比之下，数据独立获取质谱（DIA-MS）能够大规模、高精度地定量低丰度蛋白质，且无需昂贵标记。基于DIA-MS的蛋白组学技术已成功应用于研究淹没培养的M. purpureus中MPs的分泌（Liu等人，2019）。本研究利用基于RNA-seq的转录组学和基于DIA-MS的蛋白组学分析，对比了三种产生不同量MPs和CIT的M. purpureus菌株。我们的研究识别出与菌株MPs和CIT生成能力差异相关的DEGs和差异积累蛋白质（DAPs）。高通量RNA-seq和DIA-MS分析的定量结果通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和并行反应监测质谱（PRM-MS）分别进行了验证。我们还整合了转录组学和蛋白组学数据集，发现差异表达并不总是导致蛋白质丰度的差异。尽管如此，那些编码DAPs的DEGs/DAPs可能是影响真菌细胞在次级代谢产物生物合成高峰期代谢资源分配的关键因素。此外，DEG/DAPs可作为工业菌株育种的标志物。

章节片段

真菌菌株、培养及生物量、MPs和CIT含量的测定

Monascus purpureus M3（MPs和CIT含量非常高；中国中央菌种保藏中心[CCTCC，武汉，中国] M2022958）、M. purpureus M34（MPs含量非常高但CIT含量低；CCTCC M2022959）和M. purpureus M69（MPs和CIT含量极低；CCTCC M2023550）均分离自中国福建省（Huang等人，2023；Yang等人，2017）。种子培养及液体培养基中MPs和CIT的培养方法如前所述，但作了一些修改（Huang等人）。

具有不同MPs和CIT生成能力的M. purpureus菌株

我们在收集的菌株中发现了三种具有特征性不同MPs和CIT水平的M. purpureus菌株。在有利于次级代谢产物产生的液体培养基中，三种菌株的生物量积累情况相似。因此，在初级代谢生长阶段，生物量迅速增加，24小时时达到7.58–8.75克/100毫升的峰值，随后进入一个生物量稳定的阶段并略有下降（图1A）。MPs和CIT的积累在36小时的延迟期后开始。

结论

组学技术有望揭示Monascus属中MPs和CIT生物合成的调控机制及其与其他细胞代谢和发育过程的关联（Huang等人，2021；Zhang等人，2024）。尽管越来越多的证据表明在mRNA或蛋白质水平上存在调控MPs和CIT生物合成的相互关联的调控回路（Tong等人，2022；Qin等人，2024；He等人，2020；Shi等人，2021），但包括转录组学在内的多组学研究仍需进一步探索。

CRediT作者贡献声明

杨成龙：软件、资源、项目管理、研究、数据管理。莫尔纳尔·伊斯特万：写作——审稿与编辑、验证、监督、项目管理、概念构思。黄颖颖：写作——初稿撰写、软件使用、资源管理、方法学设计、研究实施、资金筹集、数据分析、数据管理。邵彦春：验证、软件使用、资源管理、方法学设计、研究实施、数据分析

未引用的参考文献

Huang等人，2021；Huang等人，2023；Huang等人，2023；Li等人，2020。

利益冲突声明

I.M.声明其在TAPI Hungary Industries Ltd.拥有与本研究无关的财务利益。其他作者均无利益冲突。

利益冲突声明

☒ 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（31901803，资助给Y.H.）、福建省自然科学基金（2023J01200，资助给Y.H.）、福建省农业科学院杰出青年学者科学基金（JCQN202404，资助给Y.H.）以及芬兰VTT技术研究中心（资助给I.M.）的财政支持。作者感谢Allwegene Technology Co., Ltd.（北京，中国）在基因组、RNA和蛋白质测序方面的支持。