CAR转导与稳定性
实现稳定的CAR表达是CAR-T细胞疗效的关键决定因素，尤其在实体瘤的恶劣微环境中。病毒载体如慢病毒和逆转录病毒系统因其高效率和持久的基因表达而占主导地位，但也受到插入突变风险、高成本和生产效率低下的限制，影响了可扩展性。非病毒方法，包括转座子系统（如Sleeping Beauty、PiggyBac）、mRNA电穿孔、CRISPR-Cas9和脂质纳米颗粒递送，通过最小化突变风险、缩短生产时间并实现对CAR表达的精确控制来解决这些问题。这些方法提高了安全性、灵活性和可扩展性，推动了针对实体瘤的CAR-T疗法的发展。
逆转录病毒载体具有将其遗传物质整合到宿主细胞基因组中的独特能力，确保引入的CAR基因长期稳定表达。然而，逆转录病毒倾向于整合在转录起始位点和CpG岛附近，其长末端重复（LTR）增强子可能激活相邻的原癌基因，引发致癌转化的担忧。慢病毒载体则表现出整合到转录活跃基因内含子的偏好，与逆转录病毒载体相比，降低了插入致癌的风险。第三代自失活（SIN）慢病毒载体通过使用人源启动子进一步降低了这种风险。慢病毒还能有效转导静止（非分裂）的T细胞，并可携带更大的遗传负载，使其适用于复杂的CAR设计。
非病毒载体系统作为下一代CAR-T细胞工程平台日益受到关注。转座子系统（如Sleeping Beauty转座子）为CAR基因递送到T细胞提供了一种强大的非病毒策略，具有较低的制造复杂性。电穿孔是一种广泛使用的非病毒转染方法，能够直接递送大而复杂的CAR构建体，并同时引入多个基因，具有可扩展性和操作简单性的显著优势。纳米颗粒，特别是由可电离脂质组成的球形囊泡——脂质纳米颗粒（LNPs），因其效率和多功能性成为CAR转导中最广泛应用的类型。
CAR的长期稳定性与其结构设计内在相关。CAR由四个关键结构域组成：胞外抗原结合域、间隔区或铰链区、跨膜域和胞内信号域。抗原结合域通常由单链可变片段（scFv）组成，直接决定CAR-T细胞对肿瘤细胞上靶抗原的亲和力和特异性。铰链区位于抗原结合域和跨膜域之间，在使CAR-T细胞适应肿瘤细胞表面抗原的不同空间构型方面发挥关键作用。跨膜域将CAR锚定在T细胞膜上，确保抗原结合域的正确定位以实现有效的抗原识别和结合。胞内信号域通常源自共刺激分子，如4-1BB或CD28，可增强T细胞活化、扩增和持久性。
基因修饰以增强CAR-T疗效
基因工程策略对于增强CAR-T细胞功能、解决细胞内在缺陷和实体瘤微环境带来的多方面挑战至关重要。合成生物学已成为CAR-T细胞工程中的变革性力量，能够开发复杂的控制系统，从而增强T细胞的精确性、适应性和治疗效果。合成Notch（synNotch）受体系统是一个显著的突破，它将肿瘤特异性识别和下游CAR激活整合在一个双受体框架内。这种创新允许更靶向和可控的CAR-T细胞活性，解决免疫逃避和全身毒性等挑战。
可逆开关机制为CAR-T细胞工程开辟了新途径，提供响应特定环境线索的动态激活。这些系统通过将CAR-T细胞活性限制在肿瘤微环境中，提供了额外的安全层，从而最大限度地减少脱靶效应并增强实体瘤的治疗精确性。在临床前研究中，研究人员通过利用实体瘤的缺氧特性，将缺氧反应元件（HREs）和氧依赖性降解域（ODDs）整合到CAR构建体中。温度敏感策略进一步拓宽了控制范围。
免疫检查点破坏已成为通过对抗肿瘤驱动的免疫抑制机制来增强CAR-T细胞疗效的关键策略。检查点分子如PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3与肿瘤微环境中的T细胞耗竭和功能障碍有关。通过基因工程或抗体方法靶向这些通路可以使CAR-T细胞恢复活力，提高其在实体瘤中的持久性和抗肿瘤活性。在临床前研究中，一个突出的方法是利用CRISPR/Cas9技术通过沉默PD-1表达来增强CAR-T细胞功能，从而减轻CAR-T细胞耗竭并提高其在肿瘤内的持久性。
细胞因子和趋化因子是T细胞活化、扩增和迁移的重要调节剂，使其成为增强CAR-T疗法的有价值靶点。旨在增强细胞因子分泌或趋化因子受体表达的基因工程策略在克服实体瘤微环境的免疫抑制屏障方面显示出前景。IL-12是一种关键的促炎细胞因子，通过激活细胞毒性T细胞和自然杀伤（NK）细胞来调节肿瘤微环境，从而放大抗肿瘤反应。IL-2和IL-15同样关键，可增强T细胞增殖和持久性。此外，趋化因子工程作为一种改善CAR-T细胞归巢和浸润在TME内的方法而受到关注。
原位操控以增强CAR-T疗效
原位操控策略代表了克服CAR-T细胞疗法在实体瘤中固有局限性的变革性方法，在肿瘤微环境中提供局部和持续的免疫反应。
CAR-T细胞的局部给药在实体瘤环境中具有显著的治疗优势，直接解决了全身给药的局限性。这些局限性包括向肿瘤部位的低效运输、脱靶细胞毒性以及降低的抗原特异性。通过专注于位点特异性给药，局部方法旨在增强CAR-T细胞在TME内的保留和功能，从而最大化治疗效果，同时最小化全身毒性。水凝胶由于其可调节的物理和化学特性而成为CAR-T细胞递送的多功能平台，这些特性可以模拟细胞外基质（ECM）并为T细胞活化和增殖提供支持性微环境。它们封装CAR-T细胞以及细胞因子或治疗剂的能力增强了局部免疫反应并促进了持续的抗肿瘤活性。
CAR-T细胞的原位生成标志着免疫疗法的范式转变，能够在患者体内直接工程化T细胞。这种方法绕过了传统的体外制造过程——如细胞采集、基因修饰和扩增——从而减少了生产时间、最小化了成本并简化了临床实施。在临床前研究中，已经开发出一种经过修饰可进行瞬时工程化的CAR-T细胞疗法。该疗法通过注射LNP递送的mRNA在体内产生，可有效重编程T细胞以识别心脏纤维化细胞。除了水凝胶，其他生物材料也在被探索以改善CAR-T细胞的递送和定位。
调节肿瘤细胞成分以提升CAR-T疗效
肿瘤微环境通过创建物理、血管和免疫屏障来阻碍CAR-T疗法。我们总结了旨在通过靶向关键TME成分来克服这些障碍的先进策略：癌症相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤血管系统和免疫抑制细胞。通过调节这些因素，我们寻求增强CAR-T细胞浸润，恢复抗肿瘤免疫力，并最终改善实体瘤的治疗效果。
癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过促进致密ECM的形成，显著阻碍了CAR-T细胞在实体瘤中的浸润。CAFs还通过分泌细胞因子和生长因子，在塑造免疫抑制性肿瘤微环境、促进肿瘤生长、血管生成和免疫逃避方面发挥关键作用。成纤维细胞活化蛋白（FAP）是一种主要由CAFs表达的标志物，已成为一个有前景的治疗靶点。FAP通过重塑ECM、促进血管生成和抑制抗肿瘤免疫反应来促进肿瘤进展。靶向FAP可以破坏这些过程，从而增强CAR-T细胞在实体瘤中的浸润和疗效。
肿瘤血管系统是CAR-T细胞浸润的关键屏障，异常血管导致缺氧、免疫逃避和药物递送减少。靶向肿瘤内皮细胞具有双重好处：破坏血液供应以诱导肿瘤细胞死亡，以及通过使血管正常化来促进CAR-T细胞浸润。早期研究表明，用CAR-T靶向VEGF受体1、-2和-3（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3）可显著抑制不同类型血管化实体瘤的生长并延长小鼠生存期。此外，与CAR-T细胞共同靶向VEGFR2和肿瘤抗原已显示出增强的抗肿瘤反应，表明双靶向策略具有协同潜力。
髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Tregs）是TME的主要免疫抑制成分，导致CAR-T细胞功能障碍和肿瘤免疫逃避。MDSCs通过产生活性氧、一氧化氮和免疫抑制细胞因子来抑制CD4+和CD8+T细胞功能。同时，Tregs表达抑制性标志物，如CTLA-4、PD-1和LAG-3，进一步抑制免疫反应并促进肿瘤进展。使用全反式维甲酸（ATRA）可以通过将未成熟的髓系细胞分化为成熟的树突状细胞来减少患者的MDSC细胞。靶向Treg细胞，研究表明，抗CD25抗体消耗荷瘤小鼠体内的CD25+Treg细胞可增加肿瘤浸润CD8+T细胞并增强肿瘤清除。
CAR-T与其他免疫疗法和策略的联合
鉴于肿瘤微环境的免疫抑制性质以及适应性耐药的可能性，将CAR-T细胞与其他免疫调节策略相结合的联合疗法已成为提高治疗效果的有前景途径。合理的联合疗法，包括使用溶瘤病毒（OVs）、免疫检查点抑制剂、放疗、化疗和靶向抑制剂，正在被探索以增强CAR-T细胞疗法的疗效。
溶瘤病毒（OVs）选择性靶向并裂解肿瘤细胞，利用具有特定致癌突变的癌细胞的脆弱性。这些病毒利用癌症特异性弱点，诱导免疫原性细胞死亡并释放肿瘤相关抗原（TAAs），从而激活针对实体瘤的免疫反应。此外，OVs可以被工程化以表达促进CAR-T细胞招募、增殖和持久性的细胞因子或趋化因子。在临床前研究中，卵巢癌病毒经过基因工程改造以表达支持T细胞增殖和长期存活的细胞因子。在肿瘤缺乏CAR-T靶抗原的情况下，已经开发了基于OV的创新策略。
免疫检查点抑制剂（ICIs）通过调节共抑制和共刺激信号通路恢复T细胞活性，从而改变了癌症治疗。靶向CTLA-4、PD-1和PD-L1等分子的ICIs已获得FDA和NMPA等监管机构批准，广泛用于恢复被肿瘤微环境抑制的T细胞。耗尽的CAR-T细胞通常表达较高水平的抑制性受体，如PD-1、TIM-3和LAG-3，这可能会降低其疗效。将ICI治疗与CAR-T疗法相结合可以逆转这种CAR-T细胞抑制，产生协同效应。
肿瘤抗原疫苗代表了CAR-T细胞疗法的补充策略，旨在增强抗原呈递和T细胞活化。这些疫苗可以基于蛋白质、RNA、DNA或病毒载体，旨在刺激免疫系统识别肿瘤特异性抗原。当与CAR-T细胞结合时，肿瘤抗原疫苗可以增强T细胞浸润，改善抗原特异性，并提高整体治疗效果。这种协同作用的一个显著例子是，Amph-pepVIII疫苗能够招募和激活树突状细胞，从而改善肿瘤抗原的摄取和呈递。这种增强的抗原启动协同提高了临床前模型中CAR-T疗法的效果。
放疗在癌症治疗中以其双重作用而闻名：直接诱导肿瘤细胞凋亡，同时释放肿瘤相关抗原（TAAs）和损伤相关分子模式（DAMPs），共同刺激针对实体瘤的特异性免疫反应。临床证据表明，在CAR-T细胞输注前进行放疗不仅可以减少原发部位的肿瘤负荷，还可以增强T细胞向肿瘤微环境的运输。此外，与不包括放疗的治疗相比，这种方法与较轻的细胞因子释放综合征（CRS）和减少的神经毒性相关。化疗是癌症治疗的另一个基石，通常在CAR-T细胞输注前作为预处理方案使用。氟达拉滨和环磷酰胺等药物可以消耗现有的淋巴细胞，为CAR-T扩增创造生态位，同时减少免疫抑制细胞群体，包括Tregs。
