引言
宫颈癌是全球女性第四大常见癌症，在低收入和中等收入国家是妇科癌症死亡的主要原因。在印度，宫颈癌是女性中第二常见的恶性肿瘤，占所有女性癌症病例的10%。高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈癌的主要病因。尽管有有效的筛查和疫苗接种计划，印度约80%的病例在确诊时已处于局部晚期。基于顺铂的同步放化疗（CCRT）是局部晚期宫颈癌（LACC）的标准治疗方法，但30–50%的患者会出现治疗失败，导致肿瘤复发和远处转移，5年生存率仍低于60%。提高LACC的长期生存率、预防治疗耐药性和最小化转移仍然是一个重大挑战。
材料与方法
样本采集与临床数据：肿瘤组织和匹配的血液样本采集自2021年9月至2022年12月期间新诊断的IIIB期宫颈癌患者活检组织。所有患者均在帕特纳的Mahavir Cancer Sansthan接受了CCRT。根据实体瘤疗效评价标准（RECIST），将患者分为敏感组和耐药组。36个样本中，19个被归类为放化疗敏感组（完全缓解），17个被归类为放化疗耐药组（疾病稳定或疾病进展）。
蛋白质组学分析：从组织样本中提取蛋白质，进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。使用SEQUEST算法和Proteome Discoverer软件处理数据，并通过双样本t检验（P < 0.05）识别耐药组和敏感组之间差异表达的蛋白质。
基因组学分析：从癌症组织和外周血中提取基因组DNA，使用Illumina NovaSeq 6000进行全基因组测序（WGS），平均测序深度约为33×。部分样本还进行了全外显子组测序（WES）。使用Mutect2进行体细胞突变调用，使用ANNOVAR进行注释。使用CNVKit进行拷贝数变异（CNV）分析，使用Manta进行结构变异（SV）调用。使用dNdScv模型识别潜在的癌症驱动基因，并使用MutationPatterns R包进行突变特征分析。
整合分析：通过整合WES和蛋白质组学数据（来自相同患者），分析基因组改变对蛋白质组的顺式（cis）和反式（trans）影响。使用OncoKB数据库识别可操作的突变。
结果
体细胞突变图谱
对26例IIIB期宫颈癌样本（14例敏感，12例耐药）进行WGS，另外10例样本（5例敏感，5例耐药）进行WES。WGS分析共识别出9917个单核苷酸变异（SNV），中位数为每个样本381个突变，平均肿瘤突变负荷（TMB）为6.5 Muts/Mb。最常见的体细胞致病基因组改变见于KMT2D（27%）、PIK3CA（27%）、FBXW7（19%）、KMT2C（19%）、NOTCH1（19%）和CASP8（15%）。与TCGA队列和中国队列相比，印度人群中KMT2D、KMT2C和CASP8突变频率显著更高。dNdScv模型分析显示PIK3CA和HLA-B基因具有统计学显著性（q < 0.1）。突变特征分析显示，APOBEC相关特征（SBS2和SBS13）、时钟样老化特征（SBS1）以及与缺陷性DNA修复相关的特征（SBS6和SBS15）普遍存在。还意外地检测到通常与紫外线暴露相关的SBS7a特征，其原因可能与HPV感染引起的氧化应激有关。
拷贝数改变和结构变异图谱
CNV分析发现每个样本中位数有130个扩增和101个缺失。GISTIC2.0分析揭示了25个扩增峰和54个缺失峰，涉及的关键基因包括PIK3CA、TP63、EGFR、ATR、POLE、ERBB4、AKT2、ATM和CCND1。扩增的癌症相关基因富集于细胞周期调控、肿瘤抑制和DNA损伤应答等通路，而缺失基因主要与UV反应下调、凋亡、Wnt/β-连环蛋白和TGF-β信号通路中断相关。结构变异分析共识别出3037个体细胞SVs，包括1615个缺失、436个重复、427个倒位和559个易位，中位数为每个样本80个事件。多个癌症相关基因（如ERBB4、STK11、NOTCH1、EGFR、PTPRD）的编码区内发现了易位断点。
放化疗耐药宫颈癌患者的基因组改变
敏感组的中位TMB（8.5 muts/Mb）高于耐药组（4.25 muts/Mb），但差异无统计学显著性（P = 0.09）。敏感组中，KMT2D是最常突变的基因（43%），其次是PIK3CA（36%）、FBXW7（29%）。耐药组中，NOTCH2和CASP8在21%的患者中发生突变。GISTIC分析显示，耐药组在7p上有一个显著的扩增峰，涵盖EGFR。通路富集分析显示，耐药组中DNA修复和Wnt/β-连环蛋白信号通路显著富集。结构变异分析发现，STK11肿瘤抑制基因在耐药组中发生特异性缺失。此外，在12例耐药患者中的3例检测到染色体碎裂事件，涉及由染色质桥断裂、微核形成等驱动的特征，表明基因组不稳定性在耐药中的作用。
放化疗耐药宫颈癌患者的蛋白质组图谱
对5例敏感和5例耐药患者的治疗前样本进行蛋白质组学分析，共鉴定和定量了7138种蛋白质。统计分析揭示了73种蛋白质在两组间表达显著差异（P < 0.05），其中24种蛋白质的表达变化倍数超过1.5倍。在耐药组中，SERPINB7、STX3、LBP、EMILIN2和NQO2是上调最显著的前五种蛋白质。通过免疫组织化学（IHC）在更大的队列（包括IIB期和IIIB期患者）中验证了STX3在耐药组中的高表达。通路分析显示，差异表达蛋白质富集于姐妹染色单体凝聚建立、MASTL促进有丝分裂进程、生物氧化等通路。整合已发表的磷酸化蛋白质组学数据发现，在蛋白质表达和磷酸化水平上分别有72和122种蛋白质显著调控。
整合蛋白质基因组学分析
拷贝数改变（CNA）与蛋白质表达的相关性分析显示，66.96%的CNA-蛋白质对呈正相关，但未观察到显著的顺式调控效应。反式作用CNA热点分析发现，6q、9q、11p和22q等染色体区域显著影响远端基因组位点的蛋白质表达，其中6q区域影响了超过200种蛋白质的表达。这些区域内的癌症相关基因通过反式效应影响凋亡、未折叠蛋白反应、DNA修复、WNT/β-连环蛋白和Notch信号等通路。基因突变对蛋白质表达影响的分析表明，大多数突变基因通过反式效应影响DNA修复通路中一个或多个蛋白质的表达。关键通路如细胞周期调控（ATR）、PIK3CA-RTK-RAS信号（KRAS, MAPK1）和凋亡（CASP8）主要受反式效应影响。在ATR和POLE中观察到顺式效应，即突变直接影响其自身的蛋白质表达。
宫颈癌中的临床可操作突变
使用OncoKB数据库，在36个样本中鉴定了可操作的突变，证据级别涵盖1级、2级、3A级和4级。33%的样本具有1级可操作证据，11%为2级，25%为3A级，5%为4级。在6例耐药患者中观察到EGFR扩增，这提示了一个潜在的可操作靶点。经常在宫颈癌中发生突变的PIK3CA，目前在乳腺癌中已有FDA批准的靶向药物（如Alpelisib + Fulvestrant, Capivasertib + Fulvestrant），表明其是宫颈癌个性化治疗的另一个有希望的途径。
讨论
本研究首次提供了印度宫颈癌患者基于WGS的体细胞基因组改变综合分析，独特地展示了对放化疗耐药和敏感组中治疗反应相关改变的广泛而深入的分析。研究发现的关键基因（如PIK3CA, KMT2D, FBXW7, KMT2C, NOTCH1） recurrent 突变与涉及不同人群的既往研究基本一致。PIK3CA是突变频率最高的基因，其突变主要集中在螺旋结构域（E542:E545），该热点突变可促进PI3K/AKT信号通路激活。耐药组中15%的患者存在EGFR扩增，表明EGFR可能是该组患者的关键治疗靶点。在4例耐药患者中发现STK11肿瘤抑制基因的结构变异缺失，强调了其在介导治疗耐药中的潜在作用。STK11功能缺失可能通过NRF2上调抗氧化酶，从而减轻ROS诱导的损伤，导致放射抵抗。
蛋白质组学分析证实了蛋白质组谱在根据治疗反应区分患者方面的潜力。在耐药组中，SERPINB7和STX3等蛋白表达上调。IHC验证了STX3在耐药组（包括IIB期患者）中的高表达，支持其作为CCRT耐药的预测性生物标志物。STX3是一种SNARE家族蛋白，其高表达与PI3K-AKT-mTOR通路的激活相关。
通路富集分析一致地强调了DNA修复通路在放化疗耐药组中的富集，表明其在驱动治疗耐药中的关键作用。整合基因组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据构建的数据驱动通路图显示，耐药组中DNA修复通路先天激活，其特征是ATM、ATR、BRCA2和RAD50等关键成分的改变，以及CSNK2A1和SMC1A等关键蛋白的磷酸化激活。STK11缺失和STX3表达升高所驱动的通路（如PI3K-AKT信号）可能与DNA修复机制相互作用，共同导致治疗耐药。因此，STK11和STX3成为预测CCRT疗效不良的有希望的生物标志物。
结论
这项全面的基因组学和蛋白质组学分析为了解印度宫颈癌患者，特别是在放化疗反应背景下的分子图谱提供了关键见解。STX3表达升高被确定为有希望的预测治疗耐药的生物标志物，而STK11缺失预示着放化疗结局不良。此外，耐药组中的EGFR扩增突出了其作为治疗靶点的潜力，为精准医疗提供了新方向。这些发现为制定个性化治疗策略以提高疗效铺平了道路，特别是在宫颈癌负担沉重的资源有限环境中。
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