ABSTRACT
牛结核病（bTB）主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起，在加纳对牲畜和公共卫生构成重大风险。先前研究报告了不同的流行率（3%–21%）和M. bovis 菌株分布，因此需要更深入地了解bTB的分子流行病学以指导控制策略。本研究调查了从加纳屠宰场分离的M. bovis 分离株的遗传多样性和系统发育关系，并将结果与其他非洲国家的菌株进行了比较。对28株M. bovis 分离株的Spoligotyping分析确认了6种不同的间隔区类型，其中SB0944最为流行（64.3%）。MIRU-VNTR基因分型分析进一步将分离株解析为22种基因型，其中位点MIRU26、QUB26和ETR-A显示出最高的等位基因多样性。在培养确认的病例中发现了10%的混合感染，表明该地区存在多种菌株共感染的高风险。比较分析显示，加纳分离株聚集在非洲1（Af1）克隆复合体内，与来自尼日利亚、布基纳法索和喀麦隆的菌株一致，但与阿尔及利亚占主导地位（并在一定程度上在马里占主导）的BCG样菌株和其他菌株不同。西非-中非与其他地区的最小菌株同质化表明存在局部进化，这是由生态屏障、受监管的季节性移牧以及菌株之间可能的竞争性排斥所塑造的。这些发现证明需要制定反映非洲独特牲畜动态和微流行模式的区域特异性bTB控制措施。采用先进基因分型方法的加强监测可以改进疫情追踪，并为有针对性的干预措施提供信息，以减轻bTB对该地区牲畜的影响。
IMPORTANCE
牛结核病（bTB）主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起，在包括加纳在内的许多中低收入国家是一种被忽视的疾病。我们的研究显示，虽然加纳的M. bovis 菌株显示出较高的局部遗传多样性，但它们几乎完全属于西非-中非共享的单一克隆复合体（Af1）。尽管有管理季节性移牧和牛只流动的区域法规，但观察到的菌株混合表明该地区的M. bovis 存在“类岛屿”进化结构；即在西非-中非国家内部多样化，但在遗传上是隔离的。这种模式是由自然屏障（如沙漠和森林）塑造的，这些屏障限制了菌株流动，同时允许强烈的区域内传播。在这种背景下理解M. bovis 的进化对于制定有效的、区域特异性的干预措施至关重要。我们的研究结果强调需要将西非-中非视为一个相互关联但遗传上不同的bTB区域共同体，呼吁采取地方行动和协调的区域战略来减轻bTB。
INTRODUCTION
牛结核病（bTB）是一种主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的慢性细菌性疾病。虽然牛是主要宿主，但该病也在各种家养和野生物种中有报道，包括羚羊、绵羊、山羊、野猪和鹿。目前尚不清楚全球人类结核病例中有多少与M. bovis 相关的人兽共患结核有关，这对世界卫生组织的“2030年终止结核”目标构成了严重威胁。
bTB在大多数非洲国家存在，但关于其流行率和影响的全面数据仍然有限。这种信息的缺乏导致了持续的人兽共患风险，对整个非洲大陆构成了重大的公共卫生挑战。在加纳，尽管关于bTB的研究相对较少，但现有研究表明该病是地方性流行的。研究结果表明，在屠宰场屠宰的牛中bTB患病率很高，有3-21%的动物在死后检查中显示结核性病变。然而，监测和研究工作面临着相当大的挑战，主要是由于经济限制、后勤不足和基础设施不足。
bTB在牛群中的传播通过多种途径发生，包括与受感染动物的直接接触、摄入受污染的饲料或水以及吸入空气传播的细菌。在加纳，牛的广泛流动和粗放式养殖系统的主导地位促进了群间传播，增加了感染传播的风险。在bTB呈地方性流行的其他非洲国家也报告了类似的趋势，这凸显了协调区域控制措施的迫切需求。为了有效指导控制和预防策略，了解M. bovis 的遗传多样性对于识别在牛群中传播的菌株并帮助阐明传播途径至关重要。
bTB在几个发达国家通过检测和扑杀反应牛已被根除。然而，在发展中国家实施此类控制策略由于财政限制而不可行。在这种情况下，空间模式、传播和病原体多样性成为识别感染源和支持设计有针对性的控制策略（包括限制动物流动）的基本数据。
在本研究中，我们从加纳选定的屠宰场（主要屠宰设施）和屠宰点（位于更偏远地区的较小屠宰设施）收集了屠宰牛只的肉芽肿性疑似结核病变组织，对其进行分枝杆菌培养并基因分型分离株。此外，我们将来自加纳的数据集（基于Spoligotyping模式和MIRU-VNTR）与其他非洲国家的数据集相结合，使我们能够将加纳的M. bovis 菌株置于西非-中非次区域内存在的菌株遗传多样性背景中进行考量。
MATERIALS AND METHODS
研究区域
一项横断面研究旨在加纳各地选定的屠宰场和屠宰点，在牛只常规宰后检验期间收集肉芽肿性疑似结核病变组织。地区的选择基于其高牛群密度、沿主要牲畜贸易路线的战略位置以及活跃的牲畜市场的存在。在每个地区内，选择主要的屠宰场或屠宰点作为来自周围农场和市场的动物的中央处理设施。这些地点包括纳龙戈屠宰点、塔马利屠宰场、延迪屠宰点、库马西屠宰场和科福里杜阿屠宰场。样本收集发生在2023年7月至12月之间。在这些设施屠宰的大多数牛只起源于加纳境内各个地区，另有部分来自邻国，如布基纳法索和尼日利亚。
宰后检验和样本收集
在采样前获得了加纳兽医服务局（VSD）的许可和批准。所有屠宰的牛只在肉类检验期间均接受宰后检验，包括触诊、检查和切割各种器官（如淋巴结、肺、肝、脾和心脏）。当在单个动物中观察到多个病变时，全部收集用于记录；然而，仅选择最突出或最具代表性的病变进行培养。因此，分析中使用的每个培养样本均来自不同的动物。将高度提示结核病的病变组织使用无菌剪刀和镊子取出，放入适当标记的无菌塑料样本自封袋中。样本在装有冰袋的泡沫箱中运送到加纳大学诺古奇纪念医学研究所（NMIMR），在-30°C下储存。由于物流限制和实验室与屠宰场地点之间的距离，样本在处理前冷冻了一到五个月。
样本处理：去污染、培养和分离
样本的去污染和培养如Acquah等人所述。将样本在组织研磨器中匀浆。为了去污染，将匀浆后的结核结节悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，置于50 mL锥形管中。每份5 mL组织匀浆悬浮液与等体积的5%（重量/体积）草酸在标记的50 mL锥形管中于室温下间歇涡旋30分钟进行去污染。为了从悬浮液中沉淀分枝杆菌，使用离心机在4,000 rpm下离心30分钟。在小心倾倒上清液后，将沉淀物重新悬浮在2.0 mL PBS中，用于接种到罗氏（LJ）培养基上。将100 μL去污染的组织匀浆接种到四个标记的、补充的LJ培养基斜面上；其中两个LJ斜面补充了2%甘油，另外两个补充了0.4%丙酮酸钠。LJ管在37°C下培养8周，每周观察生长情况。通过将细菌菌落环转移到含有Tris-EDTA缓冲液的无菌管中来收集培养阳性分离株。然后将管在90°C下热灭活30分钟，然后运送到北海道大学人兽共患病控制国际研究所（HU-IIZC）进行进一步分析。
DNA提取和分枝杆菌物种确认
从热灭活的培养分离株中提取DNA，方法如Asante-Poku等人所述。使用Bakshi等人和Kapalamula等人描述的多重PCR assay确认分离株为M. bovis 。PCR反应混合物包含0.5 µL 10 µM每种靶向差异区（RD4）的引物，0.8 µL 25 mM MgCl2 ，2 µL 2.5 mM dNTP混合物，2 µL 5 M甜菜碱，0.1 µL 5 U/µL的GoTaq DNA聚合酶（Promega Co., Madison, WI, USA）和1 µL模板DNA。PCR反应体积用双蒸水（DDW）调整至20 µL。使用引物CBS1（5'-TTCCGAATCCCTTGTGA-3'，共同正向引物），CBS2（5'-GGAGAGCGCCGTTGTA-3'，用于M. bovis ）和CBS3（5'-AGTCGCCGTGGCTTCTCTTTTA-3'，用于M. tuberculosis ）。循环条件如下：35个循环，包括96°C变性1分钟，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，最后在72°C最终延伸3分钟。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上运行，用GelRed（Biotium, Inc., CA, USA）染色，100 V电泳25分钟，M. tuberculosis 和M. bovis 的预期条带大小分别为263 bp和168 bp。
M. bovis 基因分型
所有确认的
M. bovis 分离株的DNA用于基因分型研究。使用间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）和分枝杆菌散在重复单元-可变数目串联重复序列（MIRU-VNTR）进行分型。Spoligotyping按照Kamerbeek等人和Solo等人描述的方法进行。最初，使用设计用于直接重复序列的引物对通过PCR扩增
M. bovis 的直接重复（DR）区域。随后，将扩增的PCR产物杂交到一种专用膜上，该膜含有43种不同的寡核苷酸探针，每种探针与DR区域中的不同间隔区相匹配。分别分配数字“1”和“0”给每个间隔区，以指示间隔区在PCR产物中存在或不存在。因此，Spoligotyping模式用于生成一个八进制数字。然后将此代码输入在线数据库
https://www.mbovis.org/database.php （访问于2024年4月10日），这有助于生成相应的SB编号用于进一步分析和比较。
使用15个位点的MIRU-VNTR分型如前所述进行，并进行了微小修改（用ETR-F和QUB11a替换了Mtub29和Mtub34）以提高分辨能力。其余使用的位点是ETR-C、QUB26、QUB11b、MIRU04、QUB3232、ETR-A、ETR-B、MIRU26、MIRU16、MIRU10、Mtub30、QUB4156和MIRU31。初始变性在95°C进行3分钟，随后进行35个循环：95°C 15秒，55°C 20秒，72°C 45秒，最后在72°C延伸5分钟。对于位点QUB11b和MIRU04，引物退火温度调整为50°C。PCR产物通过电泳在制备于Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液中的2%琼脂糖凝胶上分离。凝胶用溴化乙锭染色30分钟，并轻轻摇晃。染色后，在紫外光下观察PCR产物，并使用50 bp DNA ladder确定扩增子大小。结果以数字命名报告，每个数字代表在特定位点检测到的重复次数。
MIRU-VNTR位点的等位基因多样性
计算了15个MIRU-VNTR位点中每个位点的等位基因多样性。这提供了每个位点对MIRU-VNTR作为分型辅助工具的整体分辨能力的相对贡献的指示。使用以下公式估算每个位点的等位基因多样性（h ）：
h = 1 - ∑xi 2 [1 / (n (n - 1))]
其中 xi 是该位点上第i 个等位基因的频率，n 是分析的分离株数量。等位基因多样性值（h ）分类如下：h ≥ 0.6的位点被认为具有高等位基因多样性，表明存在显著的遗传变异性；0.3 ≤ h < 0.6的位点被归类为具有中等等位基因多样性，反映中等水平的变异性；而h < 0.3的位点被认为具有低等位基因多样性，表明遗传变异性有限。
系统发育分析
使用Mbovis.org数据库通过间隔区类型号定义结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis ）基因型。使用MIRU-VNTRplus在线工具分析MIRU-VNTR谱。为了研究分离株之间的遗传联系，使用了MIRU-VNTR数据。通过MrBayes编程工具计算距离矩阵，随后使用BioNumerics软件包版本7.6（Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium）绘制最小生成树（MST）和非加权组平均法（UPGMA）树。要被认为是遗传上不同的，分离株必须满足至少一个单一位点变异的最小阈值。簇被定义为共享相同Spoligotyping模式和/或MIRU-VNTR模式的两个或更多分离株的组。
加纳与邻近非洲国家M. bovis 遗传变异的比较
生成了饼图和新月图（MST）来检查加纳的M. bovis 分离株与一些附近非洲国家的遗传多样性。图2显示了基于ECOWAS（西非国家经济共同体）区域2019年关于管理牧区流动的区域政策和应对报告，以及Egbe等人和Berger的数据，选定的西非国家及其接壤国家之间牛的跨界流动相对强度。总共有552个分离株被纳入分析，包括Acquah等人在加纳报告的198个分离株，本研究中收集的加纳额外分离株（n = 28），以及其他非洲国家的分离株，如布基纳法索（n = 25）、喀麦隆（n = 214）、尼日利亚（n = 26）和马里的分离株（n = 20）。此外，考虑到北非和撒哈拉以南非洲菌株之间的进化关系，将来自地中海地区阿尔及利亚的41个分离株用于Spoligotyping比较目的。所有非非洲1（Af1）菌株被排除在向下的VNTR MST分析之外。来自非洲国家的分离株的选择标准包括以下内容：
(i) 地理起源：分离株来自与加纳邻近的西非国家接壤的国家或是西非的一部分，用于VNTR分析时排除地理上与撒哈拉以南非洲不同的地区的分离株。
(ii) 缺失数据：在10个VNTR位点中，缺失数据点不超过三个的分离株被纳入。
使用十个VNTR位点——ETR-C、QUB26、QUB11b、MIRU04、ETR-A、ETR-B、QUB11a、MIRU26、MIRU16和Mtub30——来构建网络。然后使用以下公式估算M. bovis 聚类率（CR）：
聚类率（CR）= nc / N
其中 nc 是聚类菌株的数量，N 是分析的总菌株数。
RESULTS
总共分析了来自五个不同采样地点的69份疑似结核病变样本。大多数样本来自塔马利（59.4%），其次是库马西（17.4%）、延迪（13.0%）、纳龙戈（8.7%）和科福里杜阿（1.4%）。从69份疑似结核病变样本中获得了28株M. bovis 分离株。五个地点疑似结核样本和M. bovis 分离株的分布总结在表1中。
加纳M. bovis 间隔区类型的地理分布和多样性
本研究中分析的所有28个分离株均通过多重PCR assay确认为M. bovis 。Spoligotyping揭示了六种不同的间隔区类型：SB0944、SB0300、SB0328、SB1026、SB1027和SB2757。所有28个分离株都属于Af1克隆复合体，其特征是缺少间隔区30。本研究中间隔区类型的分布呈现在表2中。分布在不同地点有所不同。一个分离株SB2757，分离自库马西，与其他间隔区类型不同，显示出从间隔区4到间隔区26的大片段缺失。
病变模式、组织类型与M. bovis 间隔区类型之间的关联
研究了病理学表现与流行的M. bovis 菌株之间的关系。病变模式分析显示，虽然主要的间隔区类型SB0944和SB0300分别与高比例的全身性疾病相关（66.7%和80.0%）（表3），但这种关联在统计学上不显著（Fisher精确检验，P = 0.206）。为了进一步评估传播能力，我们分析了不同组织类别中间隔区类型的分布（表4）。再次发现没有显著的统计学关联（P = 0.415）；然而，描述性数据信息量很大。主要的间隔区类型SB0944表现出广泛的组织嗜性，从所有组织类别中分离出来，并且在肺外器官感染中占大多数（5/7）。类似地，SB0300也从多个肺外部位培养出来。
基于15个MIRU-VNTR位点的分子分析
在随后的MIRU-VNTR分析中，三个分离株，即DB059、DB066和DB071（表S1），被排除，因为它们在几个VNTR位点上显示出多带，证明存在混合感染。因此，25个分离株用于VNTR分析。因此，本研究中确定的六种Spoligotyping模式在加入MIRU-VNTR数据后被进一步表征为22种不同的基因型（图3a）。主要的间隔区类型SB0944和SB0300各自被进一步区分为13种和4种独特的基因型。其余的间隔区类型各自最多细分为两种基因型。
MST揭示了两个主要组别（图3b）。A组主要由来自塔马利和库马西的分离株组成，观察到的主要间隔区类型是SB0944和SB0300。B组包含分离自延迪、塔马利、库马西和纳龙戈的基因型，并由SB0944间隔区类型主导。
等位基因多样性
分析MIRU-VNTR位点获得的结果呈现在表5中，其中包括了每个位点的别名、观察到的每个等位基因的串联重复数、等位基因变异（AV）和每个位点的等位基因多样性（h ）。h 值范围从0到0.72，反映了每个位点的遗传多样性水平。在分析的位点中，MIRU26、QUB26和ETR-A表现出最高的等位基因多样性，值分别为0.72、0.64和0.60。QUB11a、ETR-C、ETR-B和QUB11b显示出中等等位基因多样性指数，范围在0.3到0.6之间。另一方面，MIRU04、MIRU31和VN2401表现出较差的等位基因多样性（h < 0.3）。其余位点没有显示遗传变异。
将加纳分离株与邻国分离株的多样性置于背景中考察
表6显示了本研究中使用或从文献中检索的每个国家包含在每张图中的分离株数量。阿尔及利亚和马里数据集被排除在VNTR分析之外，因为它们不符合先前概述的纳入标准。
Spoligotyping结果揭示了六个非洲国家中M. bovis 克隆复合体的明显地理多样性（图4；表S2）。来自阿尔及利亚（采样地点位于地中海地区）的大多数分离株属于BCG样和欧洲2（Eu2）克隆复合体。这些BCG样分离株显示出与疫苗株BCG相似的Spoligotyping模式。欧洲1（Eu1）和Eu2克隆复合体，分别以缺少间隔区11和21为标志，仅在阿尔及利亚被识别。在阿尔及利亚没有检测到Af1克隆复合体。相比之下，Af1克隆复合体在西非-中非国家中最流行。
在加纳，SB0944占主导地位（42%），其次是SB0300（14%）。大多数SB类型，包括SB0944和SB0300，属于Af1克隆复合体（94%），而6.2%属于BCG样和其他复合体。在喀麦隆，SB0944是最常见的Af1类型，其次是另一个Af1类型SB0953，而只有一小部分分离株（0.5%）被归类为BCG样。在尼日利亚，所有分离株（100%）被识别为Af1。
在布基纳法索和马里，大多数分离株也属于Af1克隆复合体，尽管多样性有限。在马里，70%的分离株是Af1，而30%是非Af1，SB0134。这项基于Spoligotyping的分析的聚类率（CR）为0.93。
使用10个MIRU-VNTR位点，基于284个Af1分离株的综合数据集构建了一个MST。结果揭示了加纳分离株与其他西非-中非国家分离株之间的密切关系。加纳分离株似乎分布多样，64%的分离株与其他国家的分离株形成簇（图5）。MIRU-VNTR分析的聚类率低于Spoligotyping，为0.75。
DISCUSSION
bTB是一种主要由M. bovis 引起的传染性传染病，影响牛群并构成重大的公共卫生风险。加纳一家屠宰场的既往研究由Adu-Bobi等人进行，结果显示，73.1%具有提示bTB病变的胴体在显微镜检查中发现抗酸杆菌，这表明通过食用受污染的牛肉存在人兽共患传播的潜在风险。另一项在加纳乳制品和研究农场进行的研究报告称，牛群中bTB的患病率为2.48%，并鉴定出结核分枝杆菌复合群（MTBC）物种，包括非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum ）。
在本研究中，我们旨在调查从加纳各地屠宰场分离的M. bovis 的分子多样性和系统发育关系，并将其与现有数据的邻近非洲国家的M. bovis 分离株进行比较。了解不同地区M. bovis 的遗传多样性和传播模式对于制定有效的bTB控制策略至关重要，并且可以提供对区域变异和潜在传播来源的宝贵见解。
所有28个分离株均被确认为M. bovis ，这与Acquah等人的发现一致，他们报告加纳的bTB主要由动物适应性物种M. bovis 引起，只有1%由人类适应性物种（非洲分枝杆菌和严格意义上的结核分枝杆菌）引起。这与来自埃塞俄比亚的Ameni等人的发现形成对比，他们报告称，放牧牛中约27%的分离株是结核分枝杆菌。
我们的研究在加纳选定的屠宰场发现了不同的M. bovis 间隔区类型，为已知的加纳M. bovis 分布和多样性增加了信息。Spoligotyping结果揭示了加纳存在六种不同的M. bovis 间隔区类型，全部属于Af1克隆复合体，其中SB0944最为流行（64.3%），尤其是在北部的塔马利、延迪和纳龙戈地区。这一发现与Acquah等人一致，他们也报告SB0944在加纳北部地区占主导地位，占其分离株的37.9%。此外，我们发现了SB0300，一种Af1的亚克隆变体，占我们分离株的17.9%，与Acquah等人报告的12.8%相似。我们的结果支持Af1克隆复合体在加纳的主导地位，反映了在整个西非观察到的模式，并突出了非洲2（Af2）克隆复合体菌株的缺失，后者在东非占主导地位。
有趣的是，在库马西的一个分离株中观察到的间隔区类型SB2757（3.57%；1/28）缺失了间隔区4-24和26。间隔区25的存在是由 于 其 已 知 的
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