WNK4和FKBP5在哮喘中的作用：来自生物信息学分析、机器学习及初步验证的见解

通过GEO数据库分析发现168个哮喘相关差异表达基因，其中FKBP5显著上调、WNK4显著下调。经功能富集和机器学习验证，确认FKBP5与免疫炎症通路相关，WNK4与蛋白酶调控相关，可作为哮喘诊断的生物标志物。实验通过细胞模型和动物实验进一步验证。

孟刘|岳丽|江天慈|戴玲玲|程哲

中国河南省郑州市450052，郑州大学第一附属医院肺科与重症监护医学系

摘要

背景

哮喘的分子机制复杂且具有异质性，目前尚不完全清楚，部分患者的治疗效果不佳。本研究旨在识别具有诊断和治疗潜力的生物标志物。

方法

使用Gene Expression Omnibus获取与哮喘相关的基因表达数据，以识别差异表达基因。通过Gene Ontology、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes和Disease Ontology对这些基因进行功能和通路富集分析。利用Gene Set Enrichment Analysis和Gene Set Variation Analysis探索潜在的哮喘相关机制。通过两种机器学习算法筛选候选生物标志物，并通过ROC曲线分析进行评估。使用CIBERSORT评估免疫细胞比例，并在外部数据库、体内和体外研究中验证生物标志物的表达。

结果

168个差异表达基因（96个上调，72个下调）在异生物质刺激、谷胱甘肽转移酶活性、蛋白水解负调控和内肽酶抑制剂活性方面富集；涉及谷胱甘肽代谢、通过细胞色素P450的异生物质代谢以及涉及DNA加合物的化学致癌作用的通路；以及与牙周炎和哮喘相关的通路。WNK4和FKBP5被确定为关键基因，并通过ROC检测进行了验证。发现WNK4与M2巨噬细胞之间存在相关性，FKBP5的表达与肥大细胞、静息NK细胞和T细胞也存在相关性。我们的研究结果表明，在哮喘患者中FKBP5表达增加而WNK4表达降低，这与数据集分析的结果一致。这种一致性增强了生物信息学评估的可靠性和有效性。

结论

本研究确定了WNK4和FKBP5作为哮喘的候选生物标志物，需要进一步的临床验证，从而有助于更深入地理解哮喘的发病机制，并为未来的治疗策略提供理论基础。

引言

哮喘是一种复杂的、异质性疾病，其特征是慢性气道炎症、高反应性、黏液过度分泌和气道重塑，影响全球约3亿人，带来巨大的临床和社会经济负担[1]，[2]。其发病机制包括免疫细胞失调、结构改变和上皮屏障功能障碍[3]。目前的药物治疗方法包括吸入性皮质类固醇、长效β-激动剂、白三烯受体拮抗剂和生物靶向疗法。尽管这些方法被广泛使用，但仍有相当一部分患者经历难治性哮喘，治疗效果较差[4]，[5]。这些局限性凸显了发现新型生物标志物以促进早期诊断和开发个性化治疗方案的迫切需求。

高通量微阵列技术的最新进展使得通过全转录组基因表达分析和多组学方法全面研究哮喘的发病机制成为可能[6]。在哮喘研究中已鉴定出几个特定标志物，包括与儿童期发病哮喘相关的ORMDL3/GSDMB变异[7]、与特应性哮喘相关的白细胞介素（IL）33和IL1RL1单核苷酸多态性[8]，以及影响肺抗氧化功能的GST基因[9]。此外，胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）被认为是Th2高表达哮喘的潜在治疗靶点[10]。尽管取得了这些进展，但在诊断精确性和治疗指导方面，与哮喘相关的基因的临床应用仍受到限制。在识别能够实现早期诊断和指导精准医疗策略的可靠生物标志物方面仍存在显著的知识空白。

基于上述研究空白，本研究利用生物信息学和机器学习方法发现了新的与哮喘相关的基因。我们分析了公开可用的基因表达数据集，以识别哮喘患者与健康个体之间的差异表达基因（DEGs）。我们还通过机器学习算法和细胞及动物模型实验验证了这些基因在哮喘中的作用。这些发现为哮喘的发病机制提供了新的见解，并为未来的哮喘诊断和治疗策略研究奠定了理论基础。

数据获取

我们从由美国国家生物技术信息中心维护的Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）获取了两组公开的哮喘相关第二代高通量测序数据，该数据库是一个可供公众访问的基因组研究数据存档[11]。这两组数据包括训练集GSE63142（包含27名正常对照组、72名轻度至中度哮喘患者和56名重度哮喘患者）

差异表达基因及其富集的功能和通路

使用“limma”包共识别出168个差异表达基因（图1A），其中96个基因在GSE63142中显著上调，72个基因显著下调（图1B）。

通过“ClusterProfile”R包对这些168个差异表达基因进行GO、KEGG和DO分析，以确定其生物学功能和通路。差异表达基因的GO注释包括生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），用于分析这些基因的功能富集情况。

讨论

本研究通过对哮喘相关GEO数据集进行全面的生物信息学分析，鉴定了168个与哮喘发病机制相关的差异表达基因。结果显示FKBP5上调和WNK4下调是哮喘的重要机制。虽然之前已有报道指出FKBP5与哮喘发病机制和免疫炎症通路的相关性，但这是首次报道WNK4在哮喘中的重要性。我们采用机器学习算法进行了分析

结论

综合来看，本研究的结果表明WNK4和FKBP5是哮喘的候选生物标志物，这一点得到了生物信息学和实验数据的证实。这些发现有助于理解哮喘的发病机制。然而，仍需在临床实践中进一步验证候选生物标志物的意义。

CRediT作者贡献声明

程哲：资金获取、概念构思。孟刘：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、正式分析。岳丽：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写。江天慈：正式分析。戴玲玲：初稿撰写、可视化

利益冲突声明

作者确认没有利益冲突。

数据和材料的可用性

本研究使用的数据集可应要求从通讯作者处获取。本研究中分析的原始GEO数据集（GSE63142）可从GEO数据库获取（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）。

伦理批准和参与同意

本研究方案已获得郑州大学第一附属医院的伦理委员会批准（批准编号2019-KY-009）。所有实验程序均符合“动物研究：体内实验报告”以及郑州大学第一附属医院动物护理意图标准和伦理与实验动物使用委员会的伦理指南。

出版同意

不适用。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号82170037）、河南省科学技术厅的重点科研项目（资助编号231111310800）以及河南省医学科学技术研究项目（资助编号SBGJ202002043）的支持。

利益冲突声明

作者确认没有利益冲突。

致谢

我们感谢郑州大学第一附属医院转化医学中心在获取分析仪器方面提供的帮助，以及河南省肝脏疾病药理学重点实验室的支持。