引言
生物制造相较于传统化学合成具有显著优势，为生产多样化化合物提供了可持续的途径。其经济可行性核心在于底层生物催化剂（如酶和微生物菌株）的性能。然而，由于生物催化剂固有的复杂性，优化它们仍然充满挑战。定向进化通过筛选突变体文库来鉴定改进的变体，在生物催化剂工程中一直起着关键作用。随着扩展搜索空间以增加发现高性能生物催化剂可能性的兴趣日益增长，对更广泛、更高效筛选能力的需求也与日俱增，这通常成为限速步骤。
高通量筛选（HTS）平台的进步，包括多孔板读数仪、荧光激活液滴分选（FADS）、荧光激活细胞分选（FACS）、机器人自动化以及集成化生物铸造厂，加速了设计-构建-测试-学习（DBTL）循环。液相色谱-质谱联用（LC-MS）等传统分析仪器精度高，但劳动强度大、通量低。为了解决这一限制，将微流控与LC-MS或拉曼光谱联用的努力旨在提高分析通量。然而，尽管这些方法无需标记，但它们面临着实际障碍，包括接口不稳定性、材料不相容性或高背景噪声。此外，这两种方法都存在微流控样品处理速度快与这些检测器较慢的分析时间尺度或灵敏度之间的不匹配问题。
在使用多孔板读数仪、FADS和FACS等HTS平台时，生物传感器和检测方法是必不可少的。在生物制造中，评估生物催化剂的性能通常依赖于检测目标产物或中间体，这需要定制的生物传感器或检测方法将生化活性转化为可量化的信号。已应用于HTS平台的生物传感器和检测方法具有几个关键特征：（i）与并行化格式兼容，如多孔板、液滴或单细胞；（ii）快速且定量的响应，通常是光学信号；（iii）可扩展至数千或数百万个变体；以及（iv）最少的人工处理。
多年来，在开发和应用用于现代HTS（包括超高通量平台）的生物传感器和检测方法方面取得了进展，尽管其发展速度尚未跟上产生1010个遗传变体的技术进步。本文回顾了生物传感器和检测方法与HTS应用的最新进展，重点介绍了它们的进步、策略和局限性。进一步，本文讨论了生物传感器/检测赋能HTS可以促进机器学习（ML）引导的菌株和酶工程数据生成的新兴方向。
蛋白质基基因编码生物传感器
转录因子基生物传感器
转录因子（TF）基生物传感器是用于HTS的最通用和最广泛采用的工具之一。它们能够通过将分子识别与基因表达联系起来，实现对代谢物水平的直接、体内监测，具有高特异性、可调动态范围以及与活细胞兼容的优点。配体结合引发TF的构象变化，改变其与DNA调控序列的相互作用，从而激活或抑制报告基因的表达。TF的目标分子包括有机化学品、黄酮类化合物、群体感应分子和重金属。TF基生物传感器已在原核和真核细胞中开发并演示用于HTS，使用不同的平台，包括微孔板读数仪、FADS和FACS。
对于细菌等原核生物，新型TF基生物传感器已被开发并整合到基于荧光的HTS工作流程中。Tian等人在大肠杆菌中开发了一种对香豆酸（CA）响应的CarR基生物传感器，实现了25.6倍的动态范围，并能够每轮进行高达107个变体的FACS筛选。这项研究展示了一种有效的生物传感器赋能超HTS工作流程，解决了关键的生物合成瓶颈，并推进了用于p-CA及相关化合物的微生物细胞工厂开发。为了达到筛选所需的灵敏度，Wang等人最近在大肠杆菌中工程化了一种基于MphR的红霉素生物传感器，通过优化核糖体结合位点（RBS）来调节灵敏度。然后将这些生物传感器整合到FADS平台中，与红霉素链霉菌共培养，使得每个文库能够筛选约50,000个突变体。这项研究展示了使用大肠杆菌TF基全细胞生物传感器进行糖多孢红霉菌筛选，并将其适用性扩展到跨微生物物种。除了大肠杆菌，TF基生物传感器也已应用于枯草芽孢杆菌的HTS。Sun等人最近使用枯草芽孢杆菌工程化了一种TF基全细胞生物传感器，用于检测葡萄糖胺（GlcN），即酶二乙酰壳二糖脱乙酰酶（Dac）的产物，并将其整合到FADS中，筛选了约20万个Dac变体，成功分离出具有增强催化活性的改进突变体。
对于酵母等真核生物，最近也开发了新型TF基生物传感器并演示用于HTS，主要使用微孔板检测法。在CRISPR干扰（CRISPRi）菌株文库的情况下，它们大多通过竞争性生长测定和免疫染色进行筛选，缺乏易于监测的表型。为了解决这一限制，Mormino等人使用了一种基于Haa1的生物传感器来检测CRISPRi菌株文库中的乙酸，从而能够使用96孔板进行荧光筛选。
G蛋白偶联受体生物传感器
与需要目标分子进入细胞的全细胞TF基生物传感器不同，G蛋白偶联受体（GPCR）基生物传感器通过细胞表面信号检测细胞外分子。配体结合触发构象变化，激活细胞内G蛋白和下游转录反应，产生可测量的信号。GPCR基生物传感器主要在真核生物中开发，其天然的GPCR通路被重新连接以报告异源受体的活性。最近的目标分子例子包括与大麻素和阿片类药物相关的化合物，以及血清素和褪黑激素等激素。
最近的努力致力于提高GPCR基生物传感器在酵母中的生物传感性能。Shaw等人和Miettinen等人利用工程化的最小酵母菌株（删除了非必需的GPCR相关基因）来开发检测大麻素的酵母GPCR基生物传感器，并筛选合成化合物文库，提高了检测灵敏度和信号输出。尽管取得了这些进步，但大多数筛选是在微孔板中进行的，这将单次实验的筛选通量限制在102–104个变体。Asama等人开发了一种自分泌生物传感平台，使用自动图像处理器筛选封装在微滴中的细胞外肽基配体，这适用于不需要细胞分选的应用。为了进一步提高通量，Saleski等人通过工程化酿酒酵母在双乳液滴内分泌和检测血清素，开发了一种自分泌生物传感系统，随后运行FACS。这使得能够快速富集高产菌株，并允许在单次实验中以较低的成本筛选更大的文库（106−107）。总体而言，该系统作为一个多功能和双功能平台，既能够筛选突变体文库以鉴定高产菌株，也能够表征生物传感器突变体文库以进一步优化其生物传感性能。
适配体基生物传感器
适配体是能够结合多种小分子的短DNA或RNA寡核苷酸。这些适配体可以通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）进行鉴定，这是一种发现针对目标分子的合成适配体的方法。利用其靶标诱导结构变化的能力，适配体已被改造成多种传感形式，其中荧光结构转换设计非常适合集成到HTS工作流程中以实现各种应用。
DNA适配体生物传感器
DNA适配体生物传感器（例如适配体信标、适配体-互补链对、分裂适配体、基于Förster共振能量转移（FRET）的适配体传感器）依赖于合成单链DNA，该DNA结合目标分子并将结合转化为可测量的（通常是荧光的）信号。
虽然对于稳健的体内传感效果较差，但基于荧光的DNA适配体传感器具有设计简单、易于修饰、响应快、化学稳定性高和强大的多重检测能力等优点，使其非常适用于酶活性或细胞外产物的体外HTS。受一种通用互补策略的启发，该策略允许将任何感兴趣的DNA适配体方便地转化为荧光标记的适配体-淬灭剂传感器，Scheele等人将Trp DNA适配体工程化为一种基于荧光的传感器，用于色氨酸合成酶（TrpB）的定向进化。他们通过将表达TrpB的大肠杆菌突变体与传感器共同封装在双乳液滴中，将该DNA适配体传感器与超HTS平台集成，随后通过FACS进行分选。使用这种方法，他们在大约100,000个候选者中，在一天内鉴定出了一个具有五倍增强活性的酶变体。
荧光RNA生物传感器
荧光RNA生物传感器整合了一个结合荧光染料的light-up RNA适配体序列和一个靶标识别域，其中靶标结合触发构象变化，增强染料结合并产生荧光信号。这些传感器具有高度可编程性、特异性，适用于体外和体内应用。然而，它们更广泛的使用仍然受到靶标范围有限、灵敏度中等以及多重检测挑战的限制，需要在传感器设计和荧光团工程方面持续优化。微调传感域和light-up域之间的连接区是最大限度减少背景荧光和最大化靶标诱导信号的关键。使用微流控体外区室化测序（μIVC-seq），Husser等人最近优化了crcB适配体和Mango-III之间的连接区，创建了FluorMango，一种在氟化物结合时具有极强荧光的传感器。与FADS集成后，FluorMango能够在体外分选表达氟乙酸脱卤酶或非氟乙酸处理脱氯酶的大肠杆菌变体，获得了脱氟活性提高20倍的菌株。尽管功能良好，但该生物传感器的高检测限（68 µM）可能限制其在具有皮升级液滴的超HTS应用中检测低氟化物的适用性，不过优化可能会提高灵敏度。
核糖开关生物传感器
核糖开关生物传感器通常包含一个结合目标分子的适配体域和一个调节基因表达或产生可测量输出的表达平台。配体（通常是小分子、氨基酸和离子）结合诱导RNA结构重排，从而调节翻译或转录。核糖开关具有代谢负担低、响应快和特异性高等优点。合成核糖开关也可以为多种代谢物设计，比蛋白质基传感器具有更大的灵活性。与荧光RNA不同，核糖开关不需要外部染料。与HTS平台集成的核糖开关基生物传感器能够直接、体内筛选代谢表型和酶活性。
最近，一种L-色氨酸核糖开关传感器与FACS结合，用于指导L-色氨酸生物合成的多维工程。这项工作展示了一个全面的生物传感器引导框架，该框架协同地将HTS与代谢工程相结合，以实现高效的氨基酸生物制造。由于通常需要调整生物传感器的动态范围以适应各种条件，Su等人开发了一种双响应遗传电路，将核糖开关生物传感器与分层放大器结合，以增强信号强度并扩展动态范围。与琼脂板和小孔板筛选集成，该生物传感器赋能了使用RBS文库的途径优化和thrA酶文库的筛选，展示了其多功能性，并实现了高达七倍的L-苏氨酸产量提升。这项研究也展示了一种调整核糖开关的策略。
比色检测法
比色检测法通过测量酶促反应或显色指示剂产生的吸光度变化来量化分析物。尽管在小尺度下由于光程有限和信号干扰而灵敏度较低，但当与HTS平台集成时，它们仍然是筛选酶活性和细胞外反应的简单且定量的方法。
虽然传统的基于微孔板的比色检测法因其易用性而被广泛使用，但微流控吸光度激活液滴分选（AADS）已成为一种强大的超HTS技术。早期的AADS系统表现出比FADS更低的分选速率（约300 Hz），主要是因为需要更大的液滴体积（约180 pL）以获得足够的光程。最近的进展已将通量提高到与FADS匹配，甚至超过FADS。Jain等人通过集成一个与微流控通道对齐的不透明光刻掩模来降低背景噪声，展示了以1.5 kHz的速率分选约50 pL的液滴，效率达85%。使用NADH偶联检测法，他们在1小时内筛选了一个包含105个成员的醛脱氢酶文库。Kaba等人通过测量穿过聚焦光路的透射光，进一步推动了该领域的发展，开发了一种共聚焦AADS系统，实现了最小的背景噪声和准确的吸光度定量。令人印象深刻的是，该系统实现了2.6 kHz（50 pL液滴）和5.4 kHz（10 pL液滴）的分选速率，并成功应用于富集活性胆红素氧化酶变体，分选效率达99%。尽管该研究有优势，但一个较小的局限性是，随着液滴尺寸从100 pL减小到10 pL，减少光程会使检测限从100 µM增加到250 µM。
用于数据生成和机器学习的生物传感器
机器学习在酶和菌株工程中显示出潜力。然而，大多数研究依赖于相对较小的数据集，并专注于狭窄的突变范围，通常局限于活性位点附近的残基。这种局部探索限制了ML模型捕捉酶功能更广泛决定因素的能力，包括结构稳定性、折叠、变构调节以及底物或辅因子结合。在许多情况下，活性位点可能定义不清或未知，进一步限制了模型的泛化能力。因此，扩展突变搜索空间是有益的，但这需要兼容的HTS检测方法来生成足够大的数据集，同时保持足够的分辨率。将HTS检测与ML相结合，为数据驱动的酶和菌株工程创建了一个强大的框架，最近的研究越来越多地采用这种方法。
Singh等人开发了一个通用的人工智能驱动的自主酶工程平台，该平台集成了ML和生物铸造厂自动化，以实现完全自导向的蛋白质优化。酶适应性通过高通量比色和荧光测定法进行量化——一种用于卤化物甲基转移酶的碘基吸光度测定法和一种用于植酸酶的4-甲基伞形酮磷酸酯（MUP）荧光测定法——允许在4周内对四轮迭代中的约450个变体进行全自动96孔板筛选。虽然板式测定提供了高分辨率数据，但搜索空间和数据大小有限。为了克服这些限制，Zhang等人最近建立了PUSDA，一个核糖开关赋能的超HTS和大规模多bin数据生成框架，用于ML辅助的酶工程。该研究将酶变体分类为多bin性能组（包括非功能性突变体），速率为每小时10⁶个液滴，生成超过500万个数据点，产生了超越当前基于超HTS框架的二元输出的ML兼容数据集。这项工作展示了核糖开关与超HTS和ML的集成，将传统的定向进化从二元数据集转变为具有精细分辨率的多元数据集。
结论与展望
全球高通量基础设施（如自动化、生物铸造厂以及FADS和FACS等超HTS平台）的快速扩张极大地加速了定向进化和DBTL工作流程。然而，尽管硬件和自动化进展迅速，但生物传感器和检测方法的发展未能跟上步伐。这些先进筛选系统的成功在很大程度上依赖于能够将复杂生物活性转化为定量且可扩展读数的可靠生物传感器和检测方法。本文回顾了生物传感器/检测赋能的HTS在酶、途径和菌株工程方面的最新进展。
TF基生物传感器在HTS中仍然使用最广泛，但受到配体范围有限以及为新靶点工程化TF的困难所限制。扩展传感机制的种类——包括GPCR、核糖开关或DNA适配体基传感器将非常有益。虽然许多生物传感器已证明与微孔板筛选兼容，但成功集成到超HTS系统（如FADS或FACS）中的较少，这主要是由于稳定性、信号噪声和环境敏感性相关的挑战。随着DNA合成和文库构建技术的不断进步，该领域正在转向在超高通量条件下稳健运行，尽管许多生物传感器仍需要进一步优化才能在单细胞或皮升级液滴系统中可靠运行。
能够体内检测目标分子的生物传感器，包括TF基传感器、荧光RNA和核糖开关，相对更容易集成到超HTS平台中。为了进一步扩展其适用性，共培养系统，例如在液滴内共培养传感菌株和生产菌株，提供了有前景的策略，用于检测由不同生产菌株产生的代谢物。这种方法的关键挑战包括在分选过程中保持液滴的稳定性和完整性，特别是对于通过FACS处理的双乳液滴。然而，通过仔细优化液滴配方和筛选参数，这种集成系统可以为超HTS应用实现快速且可扩展的体外检测。
HTS与ML的集成为加速酶和菌株工程提供了一个强大的框架。虽然迄今为止许多ML赋能的研究利用了TF基生物传感器或比色检测法，但结合多样化的生物传感器类型和检测模式有望进一步增强数据丰富性和模型准确性。此外，生成大型、定量和多bin的数据集将为进化轨迹提供更深入的见解。生物传感测量的标准化和跨铸造厂的可重复性对于协调全球生物铸造厂朝着数据驱动的生物技术方向发展也至关重要。
尽管HTS能够快速探索大的序列和菌株空间，但在小规模格式中鉴定的变体并不总是能转化为更大规模（例如在摇瓶或生物反应器中）的性能提升。这种差异可能是由于小规模和大规模格式之间环境条件（包括氧气、pH和营养物质）的差异造成的，这可能会影响细胞行为。通常，基于微孔板的生物传感器/检测筛选在更接近摇瓶培养条件的条件下运行。相比之下，这些问题在单细胞和液滴基超HTS中最为突出，其中扩散和资源有限的微环境条件与大规模培养明显不同，这强调了中间规模验证的必要性。尽管如此，一些研究已经成功展示了HTS和超HTS结果的放大。
展望未来，生物传感器、自动化和人工智能驱动框架的持续融合将定义下一代生物催化剂工程。通过以高通量方式将细胞活动转化为可量化的信号，先进的生物传感器和检测方法将形成实验生物学和计算设计之间的关键接口。它们的进一步发展对于实现闭环、模型引导的酶和菌株优化，以实现可持续和智能生物制造至关重要。
