摘要
蚊子由于在传播疟疾、登革热和黄热病等致命疾病中的作用，仍然是一个重大的全球健康问题。基因修饰技术的最新进展使研究人员能够更好地研究疾病传播机制，这也成为控制病媒的一种新兴方法。然而，一个主要瓶颈是需要不断饲养每种新菌株，这一过程需要大量的人工投入和空间，并且存在交叉污染、基因漂变以及菌株丧失的风险。冷冻保存提供了一种潜在的解决方案，可以将菌株无限期地储存起来，并在需要时重新激活。在这里，我们报告了一种冷冻保存方案，该方案能够成功恢复活的冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）幼虫。解冻后，82%的幼虫显示出存活迹象，包括蠕动和口器运动。大约15%的幼虫还表现出协调的游动行为。尽管解冻后的存活时间仅限于24小时，但这项研究首次证明了蚊子幼虫能够经受冷冻保存，这是实现蚊子菌株长期储存的关键一步。
1 引言
蚊子是许多严重传染病的传播媒介，包括疟疾、西尼罗河病毒、东部马脑炎、寨卡病毒和基孔肯雅热，每年导致数百万人感染[1-3]。尤其是疟疾，给全球带来了巨大的健康负担，每年造成约40万人死亡[3]。现有的病媒控制方法，如使用杀虫剂处理的蚊帐和室内滞留喷洒，已经显著减少了疾病的传播。然而，由于蚊子对杀虫剂的抗性以及室内滞留喷洒的减少，这些方法的效果已经趋于稳定[4]。创新的病媒控制方法，包括利用基因修饰技术培育出不具传染性的无菌菌株（如CRISPR-Cas9技术），在减少疟疾方面显示出潜力[5-11]。这些进展使得大量关键菌株的收集成为必要，而这些菌株需要作为活体群体进行持续维护，这既耗费成本又需要大量人力，并且存在基因漂变、交叉污染或菌株丧失的风险[12, 13]。解决这一挑战的一个方法是开发蚊子的冷冻保存方案。这样就可以将菌株无限期地储存起来，并在需要时重新激活，从而无需持续维护，同时也能作为防止菌株损失或污染的保障措施。
缓慢冷却和玻璃化是两种标准的冷冻保存方法。在这两种方法中，生物样本在冷却前会先经过冷冻保护剂（如DMSO、甘油、乙二醇等）的处理，以减少冰晶形成造成的损伤。在缓慢冷却过程中，生物样本通常使用低浓度的冷冻保护剂（约1–2 M），冷却速率约为0.3–1°C/分钟[14, 15]。另一种方法是玻璃化，这是一种“无冰”的冷冻保存方式，生物样本在快速冷却前会先使用高浓度的冷冻保护剂（>3 M），以将其保持在玻璃态[16, 17]。在多细胞系统中，玻璃化可能比缓慢冷却更有效，因为冰晶的形成常常会导致组织结构破坏[18。
关于冈比亚按蚊（An. gambiae）胚胎和幼虫的冷冻保存研究可以追溯到20世纪初[18-22]。虽然最近有一种针对斯蒂芬斯按蚊（An. stephensi）胚胎的冷冻保存方案取得了突破[22], 但该方案尚未成功应用于冈比亚按蚊的常规冷冻保存。冈比亚按蚊是传播恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的主要媒介，这种寄生虫会导致人类患严重疟疾。与细胞等较简单的生物系统相比，冈比亚按蚊的冷冻保存更具挑战性，因为其解剖结构复杂、缺乏耐冻性且不进入滞育状态。这些生物学特性要求开发专门的保存方法。因此，我们的目标是开发一种玻璃化方案，用于保存冈比亚按蚊的第一龄（L1）幼虫。
冈比亚按蚊幼虫的解剖结构和生理机能远比简单的细胞悬浮液或组织碎片复杂得多。
