抗帕金森病多糖PFP50-1通过抑制TLR4/NF-κB和PI3K/Akt通路以及抑制NLRP3炎性小体的激活来减轻神经炎症

帕金森病（PD）神经保护机制研究中，PFP50-1通过抑制TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路及NLRP3炎症小体活性，有效减轻LPS诱导的小鼠微胶质细胞神经炎症反应，逆转MMP depolarization和ROS产生，并在MPTP模型小鼠中显著改善多巴胺神经元退化。

余成|姚文|王兆涵|杨丽珍|廖俊明|邢杰宇|刘铮|盛晓燕|周玲莉|周世贵|邹健|陈海云

广东药科大学药学院，广州，510006，中国

摘要

我们之前的研究发现，从紫苏中提取的多糖PFP50-1通过抑制脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞的神经炎症反应，表现出显著的神经保护作用。然而，其抗神经炎症作用的机制仍不完全清楚。本研究分别在MPTP诱导的帕金森病（PD）小鼠和LPS诱导的小胶质细胞中评估了PFP50-1的神经保护效果及其机制。体外实验中，PFP50-1有效抑制了促炎细胞因子的过度释放。同时，PFP50-1显著下调了Toll样受体4（TLR4）、髓系分化初级反应蛋白基因88（MyD88）、核因子κB（NF-κB）、p-PI3K（磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶）和p-Akt（磷酸化蛋白激酶B）的水平。进一步研究表明，TLR4抑制剂（TAK242）和PI3K抑制剂（LY294002）显著增强了PFP50-1对LPS诱导的促炎介质的抑制作用。此外，通过抑制NLRP3炎性小体的激活，可以逆转Caspase-1、IL-18和IL-1β的过度释放。在条件培养基刺激的N2a细胞中，PFP50-1通过防止MMP去极化和ROS的产生，表现出强大的抗神经炎症毒性作用。值得注意的是，体内实验中，PFP50-1有效缓解了MPTP诱导的多巴胺能（DA）神经元退化，这与TLR4介导和PI3K介导的信号通路以及NLRP3炎性小体的下调有关。总体而言，我们的数据表明，PFP50-1的抗神经炎症作用与其下调TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路以及抑制NLRP3炎性小体激活有关，使其成为治疗PD的有希望的候选物质。

引言

帕金森病（PD）是一种慢性进行性疾病，主要表现为运动功能障碍和认知能力下降[1]。PD的标志性特征是大脑中黑质致密部（SNpc）的多巴胺（DA）神经元选择性退化[2]、[3]、[4]。越来越多的证据表明，神经炎症是包括PD在内的神经退行性疾病的关键致病因素[5]、[6]、[7]。小胶质细胞是神经炎症反应的主要调节者[8]、[9]。

稳态小胶质细胞对中枢神经系统（CNS）的微环境平衡至关重要[10]、[11]。然而，过度的外部刺激会促使静息状态的小胶质细胞向促炎型M1表型转变，从而导致慢性神经炎症，进而加速PD的进展[12]。这种转变的特点是促炎因子（如COX-2、iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-α）的过度释放[13]、[14]。这些因子导致DA神经元退化，并通过多种信号通路促进ROS介导的细胞毒性应激[15]。因此，形成了一个自我延续的循环，加速疾病进展和DA神经元的丢失。因此，抑制小胶质细胞介导的神经炎症是治疗PD的关键策略。

TLR4介导的小胶质细胞激活是神经炎症发生和进展的关键机制[16]。激活后，MyD88接收来自TLR4的信号传导，触发下游信号级联反应，最终导致NF-κB的激活。这种转录因子迁移到细胞核，促进编码促炎介质的基因表达，从而使小胶质细胞向经典M1表型极化——这是持续神经炎症反应的关键事件[10]、[17]、[18]。同时，PI3K/Akt信号通路通过促进NF-κB的核转位和增强转录活性，在NF-κB激活中起关键调节作用。最新研究表明，在LPS诱导的小胶质细胞中激活PI3K/Akt通路会导致促炎介质的mRNA水平增加2到3倍[19]、[20]、[21]。由此产生的促炎环境会加剧线粒体功能障碍，导致活性氧（ROS）的释放增加[22]和线粒体膜电位（MMP）失衡[23]。重要的是，这种氧化还原失衡会促进NLRP3炎性小体的激活，导致IL-1β和IL-18的生成和分泌。这些细胞因子不仅放大炎症信号，还会诱导焦亡（一种细胞死亡形式），通过进一步释放炎症介质来持续神经炎症[24]、[25]。因此，TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信号通路共同促进NLRP3炎性小体的激活，形成一个恶性循环，维持M1型小胶质细胞的极化和神经元损伤。因此，同时抑制TLR4和PI3K信号通路以阻断NLRP3炎性小体激活的治疗策略可能是一种有前景的方法。

天然多糖是大分子化合物；许多天然物质已被证明具有强大的药理活性。由于它们具有低毒性和高生物相容性等显著优势，因此作为生物调节剂具有巨大潜力，使得多糖在制药和食品科学领域成为研究重点[26]、[27]。然而，某些多糖的生物活性仍需通过实验验证。目前关于紫苏多糖的药理活性的研究相对较少。PFP50-1是从紫苏叶子中提取的精制多糖。我们之前的研究表明，PFP50-1在3、6和12 μM的浓度下，能够抑制LPS诱导的BV2细胞中的一氧化氮（NO）、TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，表明PFP50-1在3至12 μM的浓度范围内对由神经炎症引起的疾病具有潜在的保护作用[28]。然而，PFP50-1的体内保护作用及其抗神经炎症作用的机制尚未完全明了。因此，基于我们之前的研究结果，本研究进一步探讨了PFP50-1在LPS诱导的小胶质细胞和MPTP处理的PD小鼠中的抗神经炎作用及其分子机制。

材料

BCA Regent（TFS-23227）购自Thermo Fisher。脂多糖（LPS）（BS904）、DMSO（BL165B）、无RNase水（BL510A）、DAPI（BL105A）和ECL试剂盒（BL520-1、BL520B-2）购自Biosharp。TNF-α（E-EL-M3063）、IL-1β（E-EL-M0037）和IL-6（E-EL-M0044）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自Elabscience。Trizol（108-95-2）购自Takara。最小必需培养基（MEM）（PM150410）购自Procell Life。ChamQ SYBR qPCR Master Mix

PFP50-1通过抑制LPS诱导的BV2细胞中的线粒体功能障碍来降低炎症细胞因子水平和焦亡

大量研究表明，激活的小胶质细胞过度释放促炎因子和与焦亡相关的细胞因子会直接导致神经元损伤并加剧神经炎症反应[29]、[30]。我们的初步研究表明，PFP50-1具有显著的抗炎作用[28]。PFP50-1的分子结构如图1A所示，通过HPGPC分析确定PFP50-1是一种分子量为

讨论

多项研究证实PD进展与神经炎症损伤之间存在密切关联。持续的慢性炎症会导致线粒体功能障碍和神经元损伤[44]、[45]、[46]。作为中枢神经系统（CNS）中的关键免疫效应细胞，小胶质细胞在神经炎症过程中起着关键作用；然而，它们的持续激活被认为是病理炎症的典型特征[47]、[48]。因此，治疗策略

结论

本研究结果表明，PFP50-1通过抑制小胶质细胞介导的神经炎症（尤其是通过TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/GSK3β信号通路激活的NLRP3炎性小体）以及改善线粒体功能障碍，表现出对促炎细胞因子的显著抑制作用，使其成为治疗PD的有希望的候选物质。PFP50-1还表现出强烈的神经保护作用，通过缓解神经炎症介导的神经毒性

CRediT作者贡献声明

余成：撰写 – 审稿与编辑、验证、软件使用、数据分析。姚文：撰写 – 审稿与编辑、验证、软件使用、实验研究。王兆涵：验证、软件使用、数据分析。杨丽珍：验证、软件使用、数据分析。廖俊明：验证、软件使用、数据分析。邢杰宇：数据可视化、实验监督。刘铮：数据可视化、实验监督。盛晓燕：数据可视化、实验监督。周玲莉：数据可视化、实验监督。周世贵：

伦理声明

动物实验严格遵循广东药科大学的实验室动物管理规定，并获得了该校动物伦理委员会的批准。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了广东省普通高校科学研究项目（2024ZDZX2076）、中国中医药协会青年精英科学家资助计划（CACM-2023-QNRC2-A07）以及大学生创新创业培训计划（202310573013）的财政支持。