1 引言
组织工程作为解决组织再生与器官修复需求的关键交叉学科领域，通过构建集成生物活性因子或细胞的三维（3D）生物相容性支架，展现出巨大潜力。然而，传统支架制造技术受限于几何设计灵活性不足与微观结构特征控制不佳，制约其临床转化。3D打印技术，特别是直接墨水书写（DIW），凭借其设备简单、成本低、材料适用性广等优势，为组织工程支架发展提供了新途径。但DIW技术面临的核心挑战在于实现墨水的快速固化，该过程需在维持打印形状完整性的同时，保证最终产品的力学与功能特性。现有固化策略（如光固化、热固化、冷却固化）各存局限：光固化虽快速（1–3分钟）且精度高（<100 µm），但需专用光敏材料且设备成本高；热固化适用于部分热固性材料，但高温环境可能损伤生物活性分子；冷却固化适用于低熔点或相变材料，但冷却速率与均匀性直接影响打印效果。
富含氢键的聚合物材料（如聚氨酯、壳聚糖、胶原、纤维素）凭借其动态交联特性与优异生物相容性，在组织工程中应用广泛。然而，在3D打印中，其固化速度缓慢，易导致结构坍塌，限制其在DIW中的应用。为克服此瓶颈，本文提出三种优化策略：溶剂置换法（利用与溶质不互溶但与当前溶剂互溶的替代溶剂使溶质析出）、纳米颗粒诱导微湍流（加速溶剂蒸发）、打印路径优化（调整路径以延长接触点间隔时间，为浆料固化留出更充分时间）。
2 结果
2.1 溶剂置换固化策略
DIW 3D打印材料需满足两大条件：材料需有合适溶剂确保在特定压力下连续挤出；挤出后溶剂需快速挥发使材料固化定型。以可溶于乙醇的聚氨酯（PU）为例，其分子链中氨基甲酸酯键（─NHCOO─）与乙醇羟基（─OH）形成强氢键，但乙醇分子被PU大分子链包裹，难以通过简单干燥完全去除，阻碍固化进程。红外测试显示，干燥后PU存在明显─OH峰，且加热后─NH─峰发生蓝移，表明PU分子内/间存在氢键，形成三维“笼”结构包裹溶剂分子。
采用溶剂置换策略，将打印支架浸入水中，利用乙醇易溶于水而PU不溶于水的特性，实现快速固化。发现空气中打印的PU支架难以快速固化，易坍塌层间融合；而水中打印的PU支架可快速固化并保持清晰形状。分子动力学模拟显示，无水条件下PU分子在乙醇中均匀分布；有水存在时，PU分子从乙醇中沉淀团聚。径向分布函数与相互作用能计算均证实，水存在削弱PU与乙醇相互作用，促进PU析出固化。有限元模拟进一步表明，水中PU固化程度在3分钟内可达10%，而空气中需超10分钟。
将此策略推广至其他生物医学常用聚合物材料（壳聚糖、尼龙6、胶原、纤维素），这些材料分子中含─OH、─NH2、─C=O、─NH─等易形成氢键的基团，构成氢键网络，致DIW打印困难。将其分别溶于乙酸、三氟乙酸、乙酸、1-丁基-3-甲基咪唑氯等溶液后，发现空气中难以快速固化（壳聚糖、纤维素固化时间>30分钟；尼龙6、胶原支架坍塌）。而将其置于NaOH溶液、蒸馏水、乙醇、蒸馏水中进行置换固化，材料可快速固化成型（壳聚糖~90秒；尼龙6–30秒；胶原~120秒；纤维素~90秒），支架保持优异形状与结构。
2.2 纳米颗粒诱导蒸发微湍流
经验表明，添加无机颗粒可促进溶剂蒸发。为此，采用碳化羟基磷灰石（HA）作为功能添加剂加速浆料固化。结合能计算显示，PU-乙醇结合能约为HA-乙醇的四倍，表明HA加入可调控溶剂蒸发动力学。制备HA/PU 3D打印浆料时，发现HA最大添加比例为45wt.%（PUH45），此时浆料储存模量较高，打印保真度优；超此比例易导致HA团聚，支架表面出现颗粒脱落，且浆料应力骤增，增加喷嘴堵塞风险。透射电镜显示，HA含量<45wt.%时，HA被PU包裹形成“岛屿”；达45wt.%时，HA颗粒相互连接并延伸至表面，为溶剂扩散提供通道，诱导微湍流，加速溶剂蒸发。计算流体动力学模拟证实纳米颗粒可诱导溶剂边界层内局部速度梯度与涡流。
动力学模型显示，HA增加与PU结合位点，使乙醇更易从PU-乙醇体系逃逸。扩散系数测量表明，随HA含量增加，乙醇扩散系数逐渐增大。傅里叶变换红外光谱分析显示，随HA含量增加，氢键羰基丰度与比例下降，证明HA削弱PU与乙醇溶剂间氢键。因HA与PU分子链中─NH─、酯基（─COO─）形成氢键，破坏乙醇与─NH─、─COO─间氢键，降低结合力，促进乙醇蒸发。差示扫描量热与热重分析显示，随HA含量增加，乙醇挥发温度降低，体系热稳定性提高（热降解活化能：PU=43.13 kJ·mol−1，PUH45=108.19 kJ·mol−1）。挥发速率测试表明，45wt.% HA浆料乙醇挥发速率显著增强，因HA呈半暴露状态，增加溶剂蒸发表面积与通道。浆料流变性能显示，所有浆料均呈现良好“剪切稀化”行为，利于打印；水吸收测试表明，45wt.% HA支架吸水率最高，为其余三组两倍。有限元模拟显示，45wt.% HA浆料表面50%溶剂蒸发时间<1分钟，而纯PU浆料>10分钟。
2.3 拓扑路径优化
尽管添加HA显著改善浆料固化时间，但45wt.% HA/PU浆料打印时仍因非瞬时固化出现打印缺陷，尤其在拐角位置。根本原因在于浆料固化不及时：打印第二层时，若第一层浆料未充分固化，会被打印头牵引位移或难以支撑上层浆料，导致变形。
DIW打印路径规划常见为垂直路径。基于溶剂蒸发需时，打印一层后，末端溶剂未完全蒸发。因此，选择第二层起点时应避开未完全固化位置（即终点）。以矩形模型为例，固定第一层起点于顶点A，存在4种打印路径结果（垂直打印偶数路径、垂直打印奇数路径、水平打印奇数路径、水平打印偶数路径）。第二层路径与第一层垂直，起点可为顶点1、2、3、4。通过计算不同顶点起始的第二层与第一层接触时间差，确定最优第二层起点。结果表明，无论路径数奇偶，第二层起点应选于第一层末端，以保证上下相邻层对应点接触间隔时间最长。基于此逻辑，开发Python代码优化打印路径，最大化上下层各接触点时间间隔。输入六组不同参数组合，发现这些间隔至少增加29.8秒，显著改善打印过程中浆料固化。对于不规则形状，可扩展为外接矩形，第二层路径与第一层垂直时，最优起点为最接近第一层终点的矩形顶点对角点；若第二层路径与第一层成θ角（非垂直），最优起点为最接近第一层终点的矩形顶点对角点的最近位置。
2.4 可编程支架制备
基于上述三策略（溶剂置换、无机颗粒添加、3D打印路径优化），制备系列比例复合材料并3D打印。表征其基本物理性能，以根据特性在生物医学工程中发挥不同作用。制备15wt.%（PUH15）、30wt.%（PUH30）、45wt.%（PUH45）HA的PU复合材料进行DIW 3D打印。打印过程中，所有浆料均经溶剂置换与路径优化实现快速固化。各浆料打印性显著增强，可成型多种形状无打印缺陷。打印后，四类支架孔径清晰，PU、PUH15、PUH30支架表面光滑，无HA暴露；元素含量与HA添加趋势一致，HA均匀分布于PU基体。透射电镜显示HA为纳米级，均匀分散无团聚。
因HA含量差异，四类支架矿化性能不同：PUH45支架表面形成粗大结晶良好晶体，其余三组矿晶少、晶粒小。压缩性能测试显示，随HA添加量增加，支架压缩强度与弹性模量逐渐增加；PUH45支架分别达1.34 MPa与25.2 MPa，落入松质骨强度范围。硬度测试表明，随HA含量增加，支架硬度显著增加（p< 0.001）。表面接触角测试显示，随HA添加，材料表面粗糙度显著增加，接触角逐渐减小；因PU表面能远小于HA，且HA亲水性强。HA含量达45wt.%时，大量HA暴露于支架表面，显著影响样品表面润湿性（p< 0.001）。不同HA含量支架具不同物理性能与良好打印性，为组织重建支架设计提供更多选择。
2.5 支架载药与释放应用范式
富氢聚合物可与药物形成稳定非共价键，提高难溶性药物溶解度与载药量，且氢键动态可逆性使药物在不同pH、温度或离子强度环境下实现智能响应释放。去铁胺（DFO）分子含大量─CO─、─OH、─NH─、─NH2，可与PU中─CO─、─O─、─NH─形成氢键，提高载药量与结合强度；在酸性环境（如炎症环境、骨缺损区），─NH2、─NH─、─OH质子化，导致DFO释放，实现智能响应。DFO可激活缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），上调缺氧响应基因级联，诱导血管内皮生长因子（VEGF）高表达，促进血管生成与成骨。
DFO对温度与光敏感，不适于高温与光固化3D打印，故选择载DFO的PUH45支架（DFO-PUH45）进行DIW打印。载DFO后，支架表面无明显变化，仍保持高粗糙度；打印性好，定型度高，纵截面保持良好孔隙；元素C、O、Ca、P、S均匀分布；内部孔隙清晰，孔隙率约64.9%；HA纳米级均匀分布于PU基体。红外与X射线光电子能谱分析证实DFO成功接枝至HA/PU支架，形成氢键而非简单物理混合。差示扫描量热-热重显示，载DFO后支架吸热峰升至约280°C，因DFO中─NH2、─OH、C=O引起PU分子交联，提高熔融温度。分子模拟计算显示，DFO与聚合物基质结合能高达39.6 kcal·mol−1，存在多重氢键。
DFO-PUH45支架在PBS中释放曲线呈双相：2小时内突释约35%，随后缓释至28天。早期突释因物理混合药物易释放；后期化学键合药物随支架溶胀持续释放，利于快速激活支架周围细胞HIF-1α，促进血管化与骨重建。
将支架浸入血清，表面大量吸附蛋白；细胞增殖显示两组支架上细胞良好增殖，无细胞毒性。骨髓间充质干细胞F-肌动蛋白荧光染色显示，第1天绿色F-肌动蛋白较少；第3天细胞完全铺展，DFO-PUH45组绿色荧光略强。免疫荧光观察VEGF与骨钙素（OCN），发现DFO促进VEGF与OCN表达。逆转录聚合酶链反应检测成骨相关基因（Runx2、Col-I、OCN）与血管相关基因（VEGF），显示DFO载药对支架细胞血管与成骨蛋白表达有显著影响。
矿化结节生成检测显示，DFO-PUH45组颜色最深，PUH45组次之，对照组最弱。HA作为骨组织重要组分具成骨诱导性，DFO通过促进血管化增强成骨分化，两者协同强促新骨组织再生。代谢物相对含量测量显示，DFO-PUH45组葡萄糖与乳酸量显著高于PUH45组，因DFO激活HIF-1α信号通路，使细胞大量吸收代谢葡萄糖，通过三羧酸循环产ATP，伴乳酸副产物生成。细胞代谢组学分析检测180种代谢物，其中2种下调，178种上调。聚类热图显示，白藜芦醇、芒柄花素、次黄嘌呤等与血管化相关；3-羟基丁酸、甘油3-磷酸、柠檬酸等与成骨代谢相关。差异代谢物涉及免疫、矿化、糖酵解、能量代谢、细胞膜合成等。代谢通路分析显示，DFO载药最终显著影响蛋白质消化吸收等代谢通路，干扰钙离子信号通路，在骨代谢与血管生成中起关键作用。
Micro-CT成像显示，术后4周与8周，PUH45组与DFO-PUH45组新骨沿支架生长至缺损区；DFO-PUH45组新骨组织更丰富密实。半定量分析表明，DFO载药促进新骨形成。小梁骨数量、厚度、分离度分析显示，DFO-PUH45组小梁厚度显著优于PUH45组，小梁骨分离更小。
组织切片染色显示，各实验组组织均长入支架，炎症细胞几乎无，支架生物相容性良好。第4周，DFO-PUH45组新骨小梁更均匀，支架表面密集铺展成骨细胞，多孔支架内发生新生血管；PUH45组亦见大量成骨细胞。第8周，组织完全长入支架，DFO-PUH45支架深蓝色成骨细胞更多，新骨更多均匀。对照组仍有大区域缺损。
免疫组织化学染色显示，术后两周，DFO-PUH45组大部分组织长入支架，HIF-1α阳性表达且表达水平高；PUH45组与对照组HIF-1α表达较低。血管相关因子VEGF表达模式类似HIF-1α。除DFO-PUH45组成骨相关因子OCN、骨桥蛋白（OPN）、Runx2高表达外，PUH45组亦有少量表达，为HA诱导成骨结果。肝、肾组织学分析显示，各植入组肝组织内皮结构完整，细胞排列正常，肝被膜保留，无显著病理改变；肾被膜完整，无组织增生或炎症反应。
3 讨论
实现氢键富集聚合物墨水快速固化对DIW体系结构保真度至关重要。聚合物（如PU、壳聚糖、胶原）严重依赖分子间氢键，虽有利于生物功能性，但也包裹溶剂于分子网络内，抑制快速相变。溶剂置换策略利用差分氢键亲和力：水极性更强、氢键给体/受体能力更优，优先与乙醇结合，将其从聚合物-溶剂复合物中置换。模拟与实验结果证实水促进乙醇去除并诱导聚合物沉淀。类似方法亦用于3D生物打印胶原于含重组蜘蛛丝蛋白eADF4沉淀浴中，获得优异力学性能复合材料。然氢键聚合物溶解与溶剂置换固化过程复杂，目前无可靠指导方法，仅能基于实验经验实施。
纳米颗粒添加改变墨水微观结构，增加扩散路径，降低溶剂蒸发能垒。红外结果证实HA存在降低氢键羰基峰，表明溶剂滞留减少。HA作为结构改性剂，添加30–45 wt.% HA增加支架压缩强度与弹性模量，与HA/PU复合骨支架研究一致。增强表面粗糙度与亲水性改善细胞黏附与增殖。HA仅用于成骨；若DIW打印聚合物支架用于其他组织（如皮肤、心脏等），可考虑二氧化硅、氧化锌、纳米银等实现抗菌、免疫调节等功能。
优化不良路径可导致剪切诱导坍塌、层间粘附不完整与几何不精确——尤其当墨水需时间稳定时。本研究通过有限元模拟干燥时间与应力分布，通过最大化相邻层接触时间优化逐层沉积。同行研究亦称挤出式打印路径优化可通过调整挤出顺序与延迟时间减少软材料打印变形与翘曲。实验中，修改每层起点与交替沉积方向最小化新挤出与未固化区域接触，显著提高尺寸保真度。
除力学考量外，功能生物活性对支架在再生医学中性能至关重要。DFO作为低氧模拟剂，通过非共价氢键并入HA/PU支架。PU网络提供可逆结合位点（─C=O、─NH─），HA提供多孔微环境利于药物持续释放。DFO稳定HIF-1α，导致VEGF等促血管生成基因上调。实验中，DFO载药支架显著增强VEGF与OCN表达。
对于聚合物-无机颗粒复合支架，灭菌应保持结构完整性与避免高温以保留组分生物活性。适用灭菌方法包括环氧乙烷灭菌、γ辐照、过滤灭菌、低温等离子灭菌。然γ辐照可损伤聚氨酯微观结构与力学性能；高粘度浆料过滤灭菌困难；低温等离子体渗透性有限，活性自由基可能氧化聚氨酯表层或改变药物表面官能团。故本研究优选环氧乙烷灭菌，以保持支架力学性能与DFO功能性。DFO在水环境中对水解与氧化敏感，封装于PU/HA基质内并与聚合物骨架氢键结合可保护DFO免快速降解，支持持续释放。生理条件下，DFO从PU/HA支架释放受表面可及孔扩散与聚合物松弛/降解共同控制。体外释放研究显示双相曲线——初始24小时突释因松散吸附药物，随后≥28天缓释因DFO与HA表面羟基/钙位点弱配位结合。此配位结合生理离子强度下相对稳定，限制快速解吸。PU基质在此期间水解降解最小，支持结构完整与释放动力学一致。
需提及，DFO分子中含氨基、羟基与羰基，仅为代表。理论上，任何分子结构中与基质有氢键物质均可接枝以提高载药率、延迟释放，甚至实现pH与温度响应释放。
整合溶剂置换、纳米颗粒增强蒸发、路径优化与治疗性载药代表推进3D打印生物材料的稳健策略。不同于传统光聚合物体系，该平台环境条件下运行，固有生物相容，适于细胞负载构建体与药物洗脱植入物。此策略亦避免其他DIW过程常用热固化步骤，使其与生物活性化合物兼容。体系实现可调支架设计：HA含量调控力学性能、表面能与药物相互作用；路径优化保证重现性。双功能——结构支持与生物活化——使该方法成为个性化骨再生治疗有前景候选。
4 结论
本研究通过整合溶剂置换、纳米颗粒增强蒸发与路径优化策略，解决氢键介导DIW 3D打印中溶剂截留关键挑战。所得支架实现优异结构精度，并利用氢键网络作为控释药物动态平台。实验结果表明，DFO载药富氢键支架后，通过钙信号与HIF-1α通路显著增强成骨与血管生成活性。通过建立氢键聚合物加工基本设计原则，本工作推进精准组织工程与智能治疗递送领域。所展示结构控制与生物活性双功能为复杂组织再生开辟新可能。
