摘要
尽管芳香族甲酰化反应从合成角度来看极具价值，但其生物催化版本此前尚未见报道。本研究鉴定出来自泥炭色杆菌（Chromobacterium sphagni）的辅因子非依赖性多聚体三组分酰基转移酶（CsATase），能够实现多酚底物（尤其是间苯二酚衍生物）的非天然混杂区域选择性C-甲酰化，从而扩展了酰基转移酶的反应范围。
引言
芳香醛由于甲酰基的多样性，是有机合成中普遍存在的目标和中间体。尽管已开发出多种芳香族化合物甲酰化方法，但通过C–C键形成反应对苯酚进行甲酰化在整个有机化学史上仍然是一个重大挑战。与许多化学方法相比，通过C–C键形成对苯酚进行C-甲酰化的生物催化方法仍然难以实现。本研究报道了一种前所未有的间苯二酚衍生物生物催化C-甲酰化方法，为化学方法提供了替代方案，并扩展了作用于酚类底物的酰基转移酶的催化范围。
结果与讨论
搜索混杂活性
由于苯酚的C-甲酰化尚未在代谢途径中描述，我们开始寻找无需活化（例如作为SCoA衍生物）即可转移酰基的酶。我们建立了一个可能能够在水性环境中催化酚类底物甲酰化的酶库。从NCBI数据库搜索中获得了超过100个酰基转移酶序列，从中任意选择了7个。每个序列源自不同的原核生物物种。测试发现，八种测试酶中有四种显示出甲酰化活性。除了PpATase外，两种源自假单胞菌的酶PkATase和PtATase也表现出催化活性，而CsATase也表现出良好的活性。
甲酰供体范围和反应工程
接下来研究了两种性能最佳的酶CsATase和PpATaseCH的甲酰供体范围，测试了混合酸酐、酰胺和脂肪族酯。在测试的供体中，苯甲酸酯（2a）是ATase催化的1a甲酰化中最有效的一种。CsATase达到了89%的转化率，在此方面优于PpATaseCH（72%）。值得注意的是，使用2a作为供体，仅观察到间苯二酚在C4位的单甲酰化，而例如在Reimer-Tiemann条件下，甲酰化会导致甲酰基位于C2和C4的产物（C2:C4 ∼ 2:1）。优化后选择60 mU/mL的酶浓度和70 mM的甲酰供体浓度用于后续实验室规模的实验。
底物范围
为了挖掘底物潜力，使用苯甲酸酯作为甲酰供体和CsATase作为最佳生物催化剂评估了一系列酚类化合物。在1,3位带有两个羟基的底物（间苯二酚衍生物）能被CsATase有效转化，而仅带有一个羟基的底物或羟基在1,4位的底物不被接受。间苯二酚上的4位和5位取代基被接受，而就测试而言，2位不可及。对于所有被接受的间苯二酚底物，均以区域选择性方式观察到专一的单甲酰化。
考虑到1,3,5-三羟基苯（间苯三酚1j）作为底物，可能预期会发生单、二或三甲酰化。测试间苯三酚（1j）确实发现了二取代产物4j，未检测到三取代。监测1j甲酰化过程随时间的变化表明，单甲酰化中间体3j仅在甲酰化初始阶段被检测到。值得注意的是，4j可以一步转化为抗疟疾活性分子robustadials A和B，并且是抗癌化学预防剂euglobals以及具有显著抗摄食活性的植物叶片中存在的抗污损剂sideroxylonals的前体。经过一些优化后，间苯三酚1j被有效地转化为二甲酰化产物4j，转化率优异（>99%）。
结构解析与机制
通过X射线晶体学解析了新鉴定的来自C. sphagni的酰基转移酶（CsATase）的晶体结构，分辨率为2.6 Å。CsATase是一种多酶复合物，由多个拷贝的三个独立亚基组成：PhlA、PhlB和PhlC。该组装体的结构最好描述为Phl(A2C2)2B4异源十二聚体，与先前报道的PpATaseCH结构类似。
在三个亚基（PhlA、PhlB、PhlC）中，预计只有PhlC负责甲酰化反应，其中PhlC亚基中88位（C88）的半胱氨酸可能直接参与甲酰基转移。通过位点选择性诱变将C88替换为丝氨酸。该变体以可溶形式成功表达并结晶。C88S变体的结构以1.8 Å分辨率解析，该变体和野生型结构彼此对齐良好。在生物催化转化测试中，C88S变体未显示任何甲酰化活性，证实了C88在PhlC亚基中的基本催化功能。
由于用底物进行的浸泡实验未能获得衍射良好的晶体，因此进行了分子对接实验以检查底物在CsATase晶体结构活性位点内的结合模式和方向。将底物对接至结构导致底物定位不佳，配体距离催化性Cys88太远。其原因很可能是在没有配体的情况下，晶体结构捕获了处于开放构象的酶，其中色氨酸（W211）从活性位点移开。因此，当模拟W211的闭合构象时，观察到的结合姿势与先前基于量子化学计算提出的酰化反应机制的关键步骤一致。
间苯二酚的甲酰化很可能由两个半反应组成：（i）酶被甲酰供体甲酰化（第一个半反应）和（ii）甲酰基转移到受体分子（如间苯二酚）（第二个半反应）。单独的实验表明甲酰基转移直接发生在间苯二酚的碳上，而不是通过O-甲酰化然后自发重排发生。对这些关键残基（C88, H144, Y124, H347）的诱变导致活性完全丧失，证实了它们对催化机制的必要贡献。
结论
此前未曾描述过酶催化的芳香族化合物甲酰化反应。通过筛选多聚体三组分酰基转移酶库，鉴定出来自C. sphagni的酰基转移酶（CsATase），允许将间苯二酚1a及其衍生物甲酰化，这是一种前所未有的、具有卓越区域选择性的混杂活性。转化率高达99%（例如，在10 mM底物浓度下），产物分离产率高达74%。底物模式研究表明，该酶对4位和5位的取代具有灵活性。对于间苯二酚底物，观察到区域选择性单甲酰化。在1,3,5-三羟基苯（间苯三酚）的情况下，该酶表现出二甲酰化活性，提供了各种生物活性化合物（例如robustadials, euglobals, sideroxylonals）的关键前体，转化率达99%。
通过X射线晶体学解析野生型酶和半胱氨酸变体的结构，然后进行对接，为了解底物结合和处理提供了见解。突变分析证明PhlC活性位点88位（C88）的半胱氨酸残基对催化至关重要。H144、Y124、H347也是如此。
这项研究为开发前所未有的C–C键形成反应开辟了新途径，并为利用酶进行芳香族化合物的C-甲酰化的进一步研究铺平了道路。
