摘要
本研究通过两个独立实验室（美国明尼苏达大学朊病毒研究中心与加拿大食品检验署）的平行实验，首次系统评估商业DNA提取试剂盒对致病性朊蛋白（PrPSc）的清除效果。研究采用滤膜法和磁珠法试剂盒处理慢性消耗病（CWD）阳性白尾鹿（Odocoileus virginianus）及朊病毒感染仓鼠脑组织，通过实时震动诱导转化（RT-QuIC）检测DNA洗脱液中PrPSc的播种活性。结果显示，两种提取方法均无法有效去除PrPSc，其播种活性与源组织呈高度一致性（Cohen's κ≥0.789）。CFIA通过受试者工作特征（ROC）曲线优化RT-QuIC检测时长至30小时，实现74%灵敏度与94%特异性。这一发现揭示当前核酸提取流程存在潜在生物安全漏洞，需对朊病毒相关DNA样本实施针对性防护。
引言
朊病毒（PrPSc）作为传播性海绵状脑病（TSE）的致病因子，对蛋白激酶K（PK）消化、热及化学消毒具有显著抗性。尽管核酸提取物在传统微生物学中被视为无感染性，但PrPSc与核酸的静电结合特性（如朊病毒相关纤维中残留核酸）提示其可能共纯化至DNA洗脱液。现有遗传学研究广泛使用商业试剂盒提取CWD、克雅病（CJD）等TSE样本DNA进行PRNP基因分型、全基因组测序等，但现代固相提取法对PrPSc的清除效能未知。本研究旨在通过RT-QuIC技术验证DNA提取物中PrPSc的残留风险。
材料与方法
MNPRO实验设计
从9只CWD阳性白尾鹿的21种组织（共53样本）及11只阴性鹿的6种组织（共23样本）中分别使用DNeasy（滤膜法）和MagAttract（磁珠法）试剂盒提取DNA。所有组织匀浆及DNA洗脱液均通过RT-QuIC检测播种活性，反应条件为42°C、900 rpm震荡65循环（48小时）。数据分析采用最大点比率（MPR）、最大斜率（MS）及淀粉样形成速率（RAF）三重指标，阳性判定需≥50% RAF非零且至少一项指标具统计学差异（p<0.05）。
CFIA实验设计
对88份存档白尾鹿延髓（obex）及咽后淋巴结（RPLN）DNA样本（含53份CWD阳性）进行RT-QuIC检测。通过ROC曲线确定30小时为最优检测时长，以周期阈值（CT）作为判读标准（阳性定义为≥4/8重复孔CT≤30小时）。比较30小时与65小时检测模式的灵敏度/特异性差异。
结果
MNPRO发现
DNA产量因试剂盒而异（DNeasy: 200 ng/μL vs. MagAttract: 135 ng/μL）。CWD阳性组织的DNA洗脱液中，32份样本在两种提取法中均显示播种活性，12份全阴性（含所有肌肉组织），4份仅DNA洗脱液阳性而组织匀浆阴性。终点滴定显示DNA浓度与播种活性终点呈正相关（R2=0.66, p=0.014）。PrPSc加标实验证实DNA基质对RT-QuIC动力学参数（RAF、MPR、MS）有轻微影响。
CFIA验证
30小时RT-QuIC在CWD阳性DNA样本中检出39例阳性（灵敏度74%），阴性对照中仅2例假阳性（特异性94%）。延长检测至65小时虽提高灵敏度至87%，但特异性降至74%。McNemar检验表明30小时方案在特异性与通量间取得更优平衡。
讨论
研究证实PrPSc可借由DNA-蛋白复合物形式抵抗试剂盒的PK消化与清洗步骤，其播种活性在宽浓度范围（0.3-1620 ng/μL）的DNA洗脱液中持续存在。尽管RT-QuIC活性与体内感染性的量化关系需通过动物实验进一步验证，但现有数据强烈提示实验室需将朊病毒来源DNA视为潜在生物危害。建议对策包括：对已知TSE阳性样本DNA实施朊病毒级防护（如1N NaOH或次氯酸钠去污）、避免在开放平台操作此类样本、建立RT-QuIC筛查流程以评估DNA提取物安全性。未来研究应聚焦不同提取工艺的PrPSc清除效率优化及感染性定量标定。
结论
常规DNA提取方法无法消除PrPSc播种活性，该发现要求提升朊病毒相关核酸研究的生物安全标准，直至通过动物实验明确DNA洗脱液的感染风险等级。
