肌醇六磷酸介导的鸟苷酸超分子自组装与凝胶化
引言
分子自组装已成为材料科学和生物技术领域的基本范式，其中大生物分子系统（如肽和蛋白质）展现了卓越的自组装能力。然而，随着分子复杂性的增加，在合成、纯化、表征和规模化生产方面出现了重大挑战。这种复杂性悖论促使研究人员转向简化策略：识别大型自组装分子中的基本结构 motif，并设计保留等效功能同时提供更优加工性和可调性的最小分子结构。低分子量凝胶因子（LMWGs）是这种策略的典范，它们是一类能够在极低浓度下形成三维网络以固定溶剂的小分子。在这些LMWGs中，核碱基衍生物由于其独特的结构特征组合而引起了特别关注：富含杂原子的框架促进氢键形成，平面芳香系统实现π-π堆积相互作用，以及金属配体结合的配位位点。尽管对多组分核碱基衍生凝胶系统的兴趣日益增长，但在预测和控制纤维网络内的凝胶剂组织以及理解分子水平结构变化与宏观流变性质之间的关系方面仍然存在显著的知识差距。弥合这种结构-功能差距对于推进合理设计原则和释放LMWG基材料在从生物医学设备到响应式软机器人等应用中的全部潜力至关重要。
水凝胶的表征对于探索其物理化学性质、凝胶化机制和所涉及的相互作用非常重要。特别是，结构的解释可以为分子设计和后续应用提供线索。流变测量用于理解凝胶的物理性质，如机械强度和粘弹性，而扫描电子显微镜（SEM）和粉末X射线衍射（PXRD）通常分别用于观察凝胶形态和晶相。然而，在许多研究中，凝胶样品需要经过冷冻干燥或稀释后进行后续研究。观察前需要样品预处理一直是一个主要问题。冷冻干燥过程会升华溶剂，这可能改变凝胶的质地，而稀释会导致组分浓度的变化。这两种方法都不能保证观察到原始的凝胶性质。或者，科学家们已采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）来确认特征峰位移以确认水凝胶的化学键合。尽管FT-IR提供了凝胶分子间相互作用的信息，但水凝胶作为一种富含水分的材料，会产生大量的水信号，可能干扰红外光谱的解析。类似的问题也出现在1H NMR光谱分析中，强水信号的存在可能导致光谱畸变并掩盖附近弱的溶质信号。
因此，合适的方法对于探索水凝胶结构和分子间相互作用至关重要。拉曼光谱是一种与红外光谱互补的化学键识别有用技术。这种非破坏性方法利用激光穿过分析物，并依赖于分子水平能量转移引起的光子散射。散射的高特异性提供了原子和分子结构的信息，其优点在于它可能有助于阐明一系列复杂流体系统中的结构和构象变化，并且与水溶液兼容。基于拉曼的技术已用于探索不同相中的分子相互作用。最近在凝胶体系中使用拉曼光谱的分析主要集中通过研究光谱中的高频振动带来观察自由水和受限水的变化。
在本研究中，我们采用拉曼光谱以及紫外-可见光谱（UV-vis）、小角X射线散射（SAXS）和流变分析来探索酸介导的鸟苷酸（GMP）凝胶化。据推测，在酸性pH下，GMP带负电荷的磷酸基团的质子化可以减少分子间的静电排斥，促进G-四联体的组装和G-四链体纤维的形成。不同于引入硼酸衍生物形成共价硼酸二酯主链以增强凝胶稳定性的传统策略，我们采用肌醇六磷酸（PA）在K+存在下引发凝胶化。PA是肌醇的六磷酸酯，具有多个氢键位点，可能作为交联剂。然而，它在很宽的pH范围内仍保持高电荷；如此大的分子（直径约10 Å）如何组装并稳定G-四链体并组装成凝胶网络也很有趣。我们旨在理解质子化和去质子化核苷酸、离子、空隙空间以及在网络级组装中的堆积和聚集的分子排列，这些可能有助于这些水凝胶的不同体相性质。
结果与讨论
K+配位、PA介导的GMP基水凝胶合成
PA介导的GMP基水凝胶由三个组分组成：K+、PA和GMP。首先将作为钾源的KCl与GMP混合以形成G-四链体，然后加入PA进行凝胶化。采用试管倒置法有效筛选是否发生凝胶化。有趣的是，[KCl-GMP-PA]水凝胶显示出高浊度，而使用KOH代替KCl作为钾源制备水凝胶（即[KOH-GMP-PA]）时，凝胶呈现透明状。然后通过UV-vis测量研究了[PA]和[KOH]浓度对[KOH-GMP-PA]凝胶体系的影响。所有测试样品的总吸光度低于纯GMP溶液，这可能归因于π-π堆积的G-四联体导致的减色效应。堆叠的含氮碱基之间的强相互作用减少了UV-vis吸收。最低吸光度分别在[PA] = 60 mM和[KOH] = 364.8 mM处识别，表明在这种优化条件下可以形成稳定的GMP组装的G-四链体。通过将[GMP]从0变化到120 mM，同时固定[KOH] = 364.8 mM和[PA] = 60 mM，在252 nm处归一化的UV-vis光谱如图所示。在所有测试样品中，可以观察到265-285 nm处孤立单体GMP吸收的减少和290-310 nm处离域特征吸收的增加（相对于纯GMP溶液），表明凝胶化过程中可能形成了G-四联体结构。
除了[KOH-GMP-PA]和[KCl-GMP-PA]水凝胶之间的浊度差异外，根据流变测量，两者的机械强度也不同。在这种分析中，储能模量（G′）表示存储在弹性材料中的能量量，表明样品的弹性，而损耗模量（G″）表示材料变形过程中以热形式耗散的能量，可用于量化粘性行为。如图和附图所示，确认了水凝胶的特性（弹性固体）。G′大于G″，所有测试样品中计算出的损耗因子（tan δ = G″/G′）均小于1。然而，无论GMP、PA或K+的浓度如何，[KCl-GMP-PA]水凝胶（最大G′ > 104Pa）的机械强度都强于[KOH-GMP-PA]水凝胶（最大G′ ≈ 103Pa）。频率依赖的幂律行为产生一个分数指数β，通常在0到1之间。较低的β值（接近0）反映更具弹性主导的响应，而较高的β值（接近1）对应于粘性主导的特性。如表S1和S2所示，我们测量的β值介于0.02和0.33之间，表明水凝胶具有主要的类固体凝胶行为，且幂律依赖性较弱。
pH对凝胶纤维结构的影响
[KCl-GMP-PA]和[KOH-GMP-PA]水凝胶在浊度和机械强度上的差异可能归因于两个体系中不同的pH值。KCl是一种中性盐，而KOH是一种强无机碱。在相同量的三种组分存在下（例如[K+] = 364.8 mM, [GMP] = 100 mM, [PA] = 60 mM），[KCl-GMP-PA]和[KOH-GMP-PA]水凝胶的pH值分别为1.20和6.70，彼此不同。如前所述，pH会影响GMP上鸟嘌呤的质子化/去质子化，进而导致G-四联体结构的变化。N7和N2′H之间的氢键在pH 3-5时形成，这有利于G-四链体结构的生成。或者，在pH <1.9时，N7位点被质子化（鸟嘌呤上N7位的pKa为1.9）。N7和N2′H之间的氢键相对难以形成，G-四联体结构是否保持稳定尚不清楚。然而，带负电荷的磷酸基团也可以被质子化，以降低整个体系的静电排斥力。
采用流变分析和SAXS/WAXS技术来理解pH对凝胶宏观和纳米尺度结构变化的影响。分别在pH 1、2和3下制备水凝胶[KCl-GMP-PA]。凝胶样品的浊度和机械强度随着pH降低（[PA]增加）而增加。如SAXS/WAXS图谱所示，所有测试样品在中间q区域都有一个宽的特征峰，对应于由多个G-四链体纤维形成的束在横平面（x–y平面）上的最长距离。随着pH降低，该特征峰逐渐向低q方向移动（pH 3、2和1时q分别为0.22、0.17和0.15 Å–1），这表明d-间距尺寸增加（pH 3、2和1时d分别为28.6、37.0和41.9 Å）。通过分子建模，我们已经知道[KCl-GMP-HCl]水凝胶中单根纤维的外径约为14.3 Å。根据pH 3时PA介导的GMP基水凝胶[KCl-GMP-PA]的SAXS/WAXS图谱，因此提出了双纤维束结构（d= 28.6，是单根纤维直径的两倍）。进一步将pH降至1，实验特征峰的d-间距为41.9 Å，大约是外径（14.3 Å）的三倍。G-四链体纤维有在凝胶基质中形成六边形排列的束的趋势。随着pH降低，凝胶机械强度以及浊度的增加可能是由于多根纤维聚集形成束的结果。
酸触发GMP自组装的分子相互作用
已知pH会影响G-四联体的形成和PA介导的GMP基水凝胶的纤维结构，为了简化研究体系，所有样品均保持在pH 3。除了PA，还包括盐酸（HCl）和磷酸（H3PO4）作为对照，以便更好地阐明PA与G-四链体纤维之间的相互作用。同时，使用KCl和KOH作为钾源进行比较（缩写为[KCl-GMP-Acids]和[KOH-GMP-Acids]水凝胶；“Acids”指PA、H3PO4或HCl）。从流变测试中，我们注意到K+作为配位金属至关重要。在没有K+的情况下，机械强度相对较弱（0.1 rad/s时G′ ≈ 35 Pa）。使用KCl时，在所有三种酸条件下，G′值在0.1 rad/s时达到约200-350 Pa。然而值得注意的是，以KOH作为钾源时，虽然使用PA时凝胶的机械强度仍可达到G′值（0.1 rad/s时）高达300 Pa，但在H3PO4和HCl的情况下，G′分别降至约100和50 Pa。显然，[KCl-GMP-Acids]和[KOH-GMP-Acids]水凝胶中存在不同的分子相互作用。PA如何与G-四链体纤维相互作用以维持凝胶质地和 resulting 机械强度将在后面讨论。
测量UV-vis光谱以再次确认这些条件下G-四联体的形成。对于不含K+的样品，虽然观察到A252 nm略有下降（从0.48到0.34），但归一化光谱显示没有太大差异，表明GMP分子可能只有有限的无定形单体聚集，从而减少了吸光度。相反，在[KCl-GMP-Acids]和[KOH-GMP-Acids]水凝胶的光谱中，归一化光谱显示出G-四联体形成的特征吸收，表明K+对于稳定G-四联体结构至关重要。A252 nm处从0.48到0.25的明显下降进一步表明，由于π-π堆积的G-四联体形成G-四链体，发生了减色效应。
然后进行拉曼差谱以检测强度以外的任何差异。调整系数以最小化差谱。由于凝胶样品控制在pH 3，为此的参考物是pH 3的GMP溶液（使用KOH调节pH，选择40 mM GMP制备最终溶液）。从凝胶样品中减去参考物，可以得到相同pH环境下凝胶和溶液之间分子相互作用的差异。在[GMP-Acids]、[KCl-GMP-Acids]和[KOH-GMP-Acids]水凝胶的差谱中，在666、811和1337 cm–1处存在正峰，这些代表新出现的特征。666和1337 cm–1处的拉曼位移被指定为GMP分子上糖基构象的变化。关于811 cm–1处的突出峰，先前的研究提出它可能是“磷酸二酯基团频率”（O–P=O对称伸缩模式）。在纯GMP和pH 3的GMP水溶液中也观察到这个小特征峰。凝胶化时该峰发生了显著的拉曼增色效应。这可能是由于磷酸氧与螺旋上三个碱基之外的鸟嘌呤碱基的氨基之间形成氢键（即C–O–P═O···H基团的对称伸缩振动）。
在[KCl-GMP-Acids]和[KOH-GMP-Acids]水凝胶差谱的指纹区（1470–1590 cm–1）识别出额外的特征峰。观察到1477(1475) cm–1的正特征和1487 cm–1的负特征组合，其中~1487 cm–1被指定为鸟嘌呤五元环的N7–C8伸缩模式。一旦形成G-四联体结构中的Hoogsteen氢键，会导致峰位下移约6–9 cm–1，因此可以在差谱中发现~1477 cm–1处的正特征。另一组是1574 cm–1的负特征和1585 cm–1的正特征。1574 cm–1处的拉曼位移被确定为鸟嘌呤六元环上C2连接的N2′H2弯曲模式。一旦G-四联体结构中N7和N2′H之间的氢键建立，将导致峰位上移至~1585 cm–1位置。在该区域拉曼差谱中获得的正、负、负、正特征峰，连同UV-vis测量，为含K+凝胶体系中G-四链体纤维结构的形成提供了证据，而在对照样品[GMP-Acids]（不含K+）中几乎观察不到这些特征。
除了指纹区，还在相对未探索的低波数区域（<250 cm–1）测量了不同酸介导水凝胶的拉曼光谱。与显示无峰的对照溶液相比，[GMP-Acids]凝胶在110 cm–1附近有弱信号，而[KCl-GMP-Acids]和[KOH-GMP-Acids]水凝胶在96 cm–1附近都显示出尖峰。为了排除热效应，在连续照射或不同激光功率下获取拉曼光谱，未观察到谱带位移。我们怀疑这可能是四个GMP分子通过氢键在G-四联体平面内缔合的特征，或者可能是加入K+后G-四联体平面之间π-π堆积的信号。为了澄清确切原因，在水凝胶中用Na+或NH4+替换中心的K+以检查峰位移。通过改变中心阳离子，观察到明显的峰位移。拉曼位移可能受晶格堆积的影响。较大的晶格距离具有较低的频率。Na+配位在G-四联体平面内，而具有较大离子半径的K+和NH4+位于两个堆叠层之间，导致更大的层间距离。在拉曼光谱中发现了110 cm–1（对于Na+）、99 cm–1（对于NH4+）和96 cm–1（对于K+）的阳离子特异性特征峰，对应于G-四联体层间距离的差异。增加[KCl-GMP-HCl]中的GMP或K+浓度，显示96 cm–1处的峰强度增强，这进一步证实了这种K+配位的G-四联体晶格，并表明如预期那样有更多的G-四联体组装。pH变化可能影响G-四联体组装过程中的氢键，导致[KCl-GMP-HCl]水凝胶中的峰强度变化而非峰位移。还使用不同的同位素氘代GMP分子来监测拉曼峰的变化。我们在光谱中没有观察到显著的峰位移，表明这个新识别的特征拉曼峰主要受G-四联体平面不同π-π堆积模式的影响，可以作为G-四联体组装的一个独特标记。偏振拉曼测量进一步支持了这一归属。由于π-π堆积是高度定向的，我们发现~96–110 cm–1谱带的强度对特定偏振（我们实验配置中的垂直偏振）敏感。为了确认~96–110 cm–1谱带是G-四联体π-π堆积模式特有的，我们进行了对照实验，用AMP、CMP或UMP替换GMP。在AMP、CMP和UMP的拉曼光谱中，~96–110 cm–1谱带完全消失，证实了其对G-四联体结构的特异性。我们还进行了温控拉曼测量，发现通过改变温度可以可逆地调节GMP组装解组装的结构。
由于水是水凝胶中的主要成分，研究这些水凝胶中的水分子提供了额外的见解。Hamaguchi等人利用拉曼光谱研究了-23 °C至45 °C温度范围内的水分子。通过多元曲线分辨率与交替最小二乘法（MCR-ALS）和假设加法多元分析与数值微分（HAMAND）方法，结果表明结构化的氢键水在3195 cm–1处显示出一个宽的OH伸缩带，并在约3379 cm–1处有一个肩峰，而非结构化的氢键水在约3444 cm–1处有一个宽的OH伸缩带。因此，将3200 cm–1和3420 cm–1位置分别作为结构化和非结构化氢键的特征，用于不同酸介导水凝胶的比较。图6a-c分别展示了[GMP-Acids]、[KCl-GMP-Acids]和[KOH-GMP-Acids]水凝胶在高波数区域（>2000 cm–1）的拉曼光谱，光谱中3200 cm–1和3420 cm–1处的拉曼强度比列于图6d。在所有HCl介导的情况下，比值最低，与PA和H3PO4介导的情况相比，意味着更无序的氢键网络。此外，在K+配位的GMP水凝胶中，PA介导的水凝胶具有最大的比值，与H3PO4和HCl相比，观察到PA > H3PO4> HCl的趋势，表明PA介导的水凝胶可能呈现更结构化的氢键。
为了进一步剖析水凝胶中PA介导的G-四链体组装的相互作用，在固定[GMP] = 100 mM的[KOH-GMP-PA]水凝胶体系（pH 3）中，测量了不同PA浓度（20、40、60和82 mM）下的拉曼光谱（在拉曼测量前，进行了试管倒置测试和UV-vis测量，以确认在这些条件下形成了G-四链体和水凝胶）。如图7a所示，拉曼测量显示在低PA浓度（20 mM）时出现了860 cm–1的峰，并且随着PA增加，该峰逐渐位移至850 cm–1。应用PA浓度滴定曲线和定量拟合模型来描述光谱位移的连续演变。已知纯PA溶液在pH 1时，磷酸基团的对称P–OH伸缩模式在856 cm–1处有一个特征峰。用KOH将PA溶液的pH调节至3后，该峰红移至850 cm–1。这种位移可能是由于K+与解离状态下带负电荷的磷酸羟基的静电吸引，导致键长增加。如图S2和S4方程所示，由于键长增加导致力常数减小，振动频率降低。因此观察到特征峰向较低波数方向位移（856 cm–1到850 cm–1）。
我们怀疑在[KOH-GMP-PA]水凝胶中，随着PA增加，860 cm–1到850 cm–1的峰位移指的是P–OH伸缩模式的振动频率变化。如图S8和图4所示，[GMP-PA]和[KCl-GMP-PA]水凝胶中的P–OH伸缩模式在860 cm–1处，而在[KOH-GMP-PA]水凝胶中，该峰出现在850 cm–1处。在低PA浓度下，大多数PA分子充当G-四链体纤维之间的交联剂。PA可能与G-四链体纤维相互作用，通过与GMP磷酸基或糖的羟基形成氢键来形成束，导致拉曼谱带出现在相对较高的波数（860 cm–1），因为解离度较低。或者，在高PA下，虽然仍有一些PA充当交联剂，但过量的PA表现出高解离度，库仑力增加了键长并降低了键级，导致拉曼谱带向低波数位移（850 cm–1
