引言
神经炎症是中枢神经系统（CNS）疾病的关键病理机制，在神经退行性疾病、抑郁症和认知障碍的发展中起着重要作用[1]、[2]。作为对CNS损伤、感染或慢性疾病的先天免疫反应，神经炎症主要由小胶质细胞和星形胶质细胞的异常活化驱动[3]、[4]。在生理条件下，小胶质细胞通过吞噬细胞碎片和调节突触可塑性来维持神经微环境的稳态。然而，小胶质细胞的病理性过度活化会引发过度的免疫反应，导致促炎细胞因子和活性氧（ROS）的级联释放[5]、[6]。这种恶性循环促进了神经元中的线粒体功能障碍，最终导致神经元损伤和疾病进展。当前的治疗策略面临两大挑战：（1）传统的抗炎药物，如非甾体抗炎药和糖皮质激素，由于血脑屏障（BBB）的限制，无法在脑实质中达到有效浓度[7]、[8]、[9]；（2）全身给药存在免疫抑制和代谢毒性的风险。这些限制推动了开发具有强大抗炎和抗氧化活性以及高效BBB穿透性的新型疗法的努力。
为了模拟神经炎症过程，广泛使用细菌内毒素（如脂多糖（LPS），因为它们具有强烈的先天免疫信号激活能力[10]。全身或脑内给药后，LPS会激活小胶质细胞和星形胶质细胞上的Toll样受体4，触发促炎细胞因子的释放[11]。这一级联反应紧密再现了包括阿尔茨海默病和抑郁症在内的CNS疾病中观察到的神经炎症微环境的关键特征[12]、[13]。因此，LPS诱导的模型为剖析神经炎症的分子机制、评估抗炎治疗药物以及阐明病理条件下的胶质细胞-神经元相互作用提供了一个可重复和可控的平台。槲皮素（Qu）是一种天然存在的多酚类黄酮，通过多种机制发挥强大的抗氧化作用[14]、[15]。其分子结构具有儿茶酚羟基和α,β-不饱和羰基，赋予其强大的电子供体能力，能够直接清除ROS、螯合金属离子并激活抗氧化途径[16]、[17]。在调节神经炎症方面，Qu不仅抑制小胶质细胞中促炎信号通路的活化，减少炎症细胞因子的释放，还抑制炎症级联反应中的关键蛋白复合物的形成，从而降低IL-1β等促炎介质的产生[18]、[19]、[20]。这种多靶点作用提供了神经保护效应，并延缓了包括阿尔茨海默病和帕金森病在内的神经退行性疾病动物模型中的病理进展。
然而，由于其强烈的疏水性和较差的口服生物利用度，Qu的临床应用受到限制。其显著的疏水性导致其在水环境中的溶解度极低。Qu的低口服生物利用度主要是由于肠道首过代谢、P-糖蛋白介导的外排作用以及肠肝循环过程中的广泛代谢降解[21]。为了克服这些挑战，研究人员开发了各种纳米载体，包括脂质体、聚合物胶束和纳米乳液[22]、[23]、[24]。其中，脂质体由于其两亲性磷脂双层结构而具有独特的优势。疏水性的Qu可以有效地嵌入脂质双层中，而亲水性的核心则允许共载水溶性协同剂，实现多功能递送系统的双相药物装载。与聚合物胶束和纳米乳液相比，脂质体表现出更好的生物相容性、生物降解性和功能多样性[25]、[26]、[27]。此外，表面修饰靶向配体可提高其精准性，使脂质体成为神经炎症治疗中靶向递送的理想平台。
传统的药物递送途径，如口服或静脉注射，由于血脑屏障的选择性通透性，大多数治疗药物无法在脑实质中达到有效浓度，这在神经炎症疾病中严重影响了临床效果。鼻内递送是一种非侵入性的脑靶向策略，通过嗅觉和三叉神经途径将药物直接递送到CNS，已成为克服脑靶向挑战的有希望的方法[28]、[29]、[30]。具体来说，药物分子通过嗅上皮的内吞作用进入嗅球，或通过三叉神经的轴突运输到达脑干和皮质区域，从而在整个大脑中分布。然而，由密集黏液层、黏液纤毛清除机制和紧密连接组成的鼻黏膜屏障会保留大约90%的外源性纳米载体，极大地限制了CNS的递送效率[31]。为了解决这一挑战，研究人员提出了功能化纳米载体表面以增强与嗅上皮的相互作用并促进跨黏膜渗透。在各种策略中，细胞穿透肽（CPPs），特别是短肽ERRPRGRRRGRKC（R肽），因其独特的穿越生物屏障的能力而受到关注[32]。CPPs通常由10-30个氨基酸组成，通过静电和疏水相互作用与细胞膜相互作用，促进大分子和纳米载体跨皮肤、肠道和血脑屏障等屏障的运输[33]、[34]。传统的CPPs（如TAT肽）具有广泛的穿透性，但由于非特异性细胞摄取可能导致全身毒性[35]、[36]。相比之下，R肽是通过人类来源序列的功能性高通量筛选鉴定出来的，而不是通过重新利用病毒来源的CPP。它在多种细胞类型中显示出比经典TAT肽更高的细胞摄取率[32]。在常用的浓度范围内，它还保持比TAT更高的细胞活力，从而为鼻内递送提供了更良好的生物安全性。凭借其高穿透效率、低毒性和优异的递送性能，R肽已成为克服鼻上皮屏障的关键功能性成分。
本研究旨在开发一种肽修饰的递送系统，以改善Qu的脑部递送，并评估其在LPS诱导的神经炎症模型中对神经炎症及相关功能障碍的潜在疗效。为此，我们设计并合成了一种装载了Qu的、经过R肽修饰的脂质体制剂（QuR-lipo），以实现脑靶向的鼻内递送。与传统CPP不同，结构优化的R肽在高递送效率和最小刺激之间表现出独特的平衡。我们使用体外BV2小胶质细胞模型和神经炎症动物模型系统评估了QuR-lipo的治疗效果，重点关注跨黏膜递送效率、抗炎和抗氧化活性以及行为改善。结果表明，QuR-lipo具有高包封效率并表现出缓释特性。R肽的功能化显著增强了鼻上皮的穿透性，并促进了脑部药物积累。从机制上讲，QuR-lipo通过抑制NLRP3炎性小体通路的活化并减少ROS的产生，协同中断了“炎症-氧化应激”循环。此外，QuR-lipo抑制了小胶质细胞从静息状态到活化状态的形态转变，并降低了吞噬标志物CD68的表达。在LPS诱导的神经炎症模型中，QuR-lipo显著改善了空间记忆表现并减轻了抑郁样行为。总之，这项工作为天然生物活性化合物在神经退行性疾病治疗中的靶向递送提供了新的策略。
材料
DOPC、LPS和胆固醇购自Sigma-Aldrich。DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-ERRPRGRRRGRKC（DSPE-PEG-R）由MeloPEG定制合成。ABTS和DPPH检测试剂盒购自Solarbio。BV2细胞系由Procell Life Science and Technology Co., Ltd.提供。用于Western blot分析的抗-NLRP3 Ab、抗-IL-1β Ab、抗-procaspase-1 Ab和抗-caspase-1 Ab购自Cell Signaling Technology。
QuR-lipo的制备和结构表征
短肽R是一种具有优异细胞穿透效率的新型CPP，其性能可与经典TAT肽相媲美。在本研究中，我们创新性地用R肽修饰脂质体，以提高鼻到脑的递送效率并改善治疗效果。我们使用薄膜水化法制备了QuR-lipo，如图1A所示。该过程包括通过旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀的脂质膜，然后
结论
本研究提出了一种通过QuR-lipo增强Qu脑靶向递送的有效策略。QuR-lipo具有合适的药物装载能力和缓释特性。R肽修饰显著提高了脂质体在体内的细胞摄取效率，有效抑制了小胶质细胞介导的炎症细胞因子释放和氧化应激。基于这些物理化学和细胞优势，R肽还显著提高了鼻到脑的
CRediT作者贡献声明
尹长风：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析。刘光林：数据分析。袁希贤：验证、数据分析。张玉萌：验证、数据分析。田玉山：监督、项目管理。李晓：方法学、数据分析。张玲娥：数据分析、验证。姜希群：撰写——审阅与编辑、验证、监督、项目管理、资金获取。陈欢：撰写——审阅与
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号52503207）、中国博士后科学基金（编号2024M763656）、河南省科技研究项目（编号552024AS0040）、北京生命科学研究院科技项目（编号2023000CC0070；2024500CC0070）、辽宁省联合科技计划基金（应用基础研究项目）（编号2023JH2/101700077）的支持。
