肠道和肝脏作为人体重要的免疫器官，通过门静脉循环和淋巴管紧密相连，构成了一个动态的免疫界面——肠道-肝脏轴。这一轴心不仅负责营养物质的吸收和代谢，还持续应对来自肠道菌群、饮食抗原和病原体的各种信号，在维持免疫稳态中扮演着关键角色。然而，长期以来，研究人员对于T细胞如何在不同组织间分布、克隆扩增并适应局部微环境的认识仍然有限。传统研究多采用不同供体的组织样本进行分析，个体间差异这一混杂因素使得直接比较不同组织间的T细胞特征变得困难。更重要的是，许多研究缺乏配对的T细胞受体（TCR）测序数据，而这对于理解T细胞克隆在特定抗原刺激下的扩增规律至关重要。
为了突破这些限制，研究人员在《Cell Reports》上发表了一项创新性研究，他们对同一健康供体的结肠上皮、固有层、肝脏和外周血中的T细胞进行了整合的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和配对TCR测序。这种同体设计巧妙地避免了供体间变异带来的干扰，使得能够直接比较不同组织的细胞表型、状态和克隆性。研究不仅跨越组织比较了T细胞，还特别分析了同一组织内扩增程度最高和最低的T细胞克隆之间的基因表达差异。此外，团队还运用计算生物学方法，包括NicheNet和Geneformer，进行体外扰动分析，预测调控克隆扩增和组织特异性适应的关键转录因子。
研究团队首先建立了同一供体来源的结肠（上皮内淋巴细胞和固有层）、肝脏和外周血T细胞的单细胞转录组和TCR图谱。通过质控和整合，共获得72,800个高质量T细胞。聚类分析揭示了主要的T细胞亚群：TCRαβ CD8+组织驻留记忆T细胞（TRM）在结肠上皮和肝脏中最丰富；TCRαβ CD4+TRM在结肠固有层占主导；而TCRαβ CD4+中央记忆T细胞（TCM）在外周血中最常见。黏膜相关恒定T细胞（MAIT）在肝脏T细胞中比例显著较高（平均16.39%），而γδ T细胞则在上皮和肝脏中富集。值得注意的是，与外周血中静息的T细胞不同，上皮内和肝内的T细胞，尤其是TCRαβ CD8+和γδ T细胞，即使在稳态下也表现出激活状态。
组织特异性TRM展现独特的转录程序
为了解析不同部位TRM的特异性基因表达特征，研究人员比较了结肠（上皮和固有层）和肝脏中CD4+和CD8+TRM的差异表达基因。发现结肠固有层TRM高表达整合素ITGA1（CD49a），这与组织滞留有关。CD8+固有层TRM特异性上调XCL1和XCL2，这些趋化因子对于树突状细胞的招募和交叉呈递至关重要。有趣的是，CD4+上皮内TRM与固有层TRM相比，表达更高水平的人类白细胞抗原-DR（HLA-DR）。基因集富集分析提示，固有层TRM相较于上皮内和肝脏TRM，表现出增加的干扰素-α/β和趋化因子相关信号通路。利用NicheNet模型，研究人员预测了可能驱动这些转录差异的候选配体。例如，预测到细胞外基质粘附相关配体（ARTN, GDNF）、与抗原呈递细胞和/或B细胞相互作用的配体（CD80/86, CD70, ICOSLG）以及MHC介导的激活信号（B2M）对固有层TRM的塑造起关键作用。而上皮内TRM的独特表达则可能与IL-27、IL-7和IFNG有关。肝脏特异性TRM的特征则可能受到白细胞介素（IL-4/IL-13, IL-15）和细胞因子（包括TNF）组合的影响。
跨组织克隆共享揭示结肠与肝脏TRM群体间的联系
通过配对TCR测序分析TRM群体的克隆关系，研究发现各部位间的TCR库存在显著差异。尽管所有部位都检测到一定程度的克隆共享，但Morisita重叠指数最高仅为0.32，表明每个部位的TCR库主要是独立的。克隆共享分析显示，CD4+和CD8+T细胞的主要克隆共享发生在上皮内TRM、固有层TRM和肝脏TRM之间。值得注意的是，约16%的上皮内调节性T细胞（Treg）克隆与固有层Treg共享，表明结肠FOXP3+Treg相对独立，其迁移可能受限。除了精确的克隆共享，研究还利用GLIPH2分析了不同部位细胞亚群间的基序/全局模式共享，发现基于TCR序列相似性的克隆聚类进一步支持了观察到的克隆关系。
组织与细胞亚群特异性的克隆扩增模式
通过按克隆频率对T细胞进行排名，研究发现CD8+T细胞在各部位的克隆扩增程度均高于CD4+T细胞。对于CD4+T细胞，克隆扩增主要发生在组织局部，CD8+T细胞也基本如此。每个部位扩增最显著的细胞表型也各不相同：上皮内以CD8+TRM为主，固有层以CD4+TRM为主（除一例供体为CD8+效应记忆T细胞），而外周血以CD8+效应T细胞为主。在肝脏，CD8+TRM和MAIT细胞对顶级扩增克隆贡献显著。比较同一部位、同一类型中扩增最高和最低克隆的基因表达，发现促细胞存活的IL7R在肝脏CD8+TRM和外周血CD8+效应T细胞的顶级扩增克隆中表达下调，这可能反映了效应分化。而介导免疫细胞迁移的GPR183（EBI2）在低扩增克隆中普遍表达更高，提示扩增后的细胞可能下调该受体以避免过度激活。
Geneformer体外扰动预测潜在的扩增开关
为了探索基因表达调控是否协助TRM的克隆扩增，研究人员应用Geneformer对扩增程度不同克隆间差异表达的基因进行体外扰动模拟。预测发现，参与代谢重编程（如ATP5F1E, LDHB）、细胞骨架重塑（如VIM, MYL6）、钙信号（如S100A6, S100A10）的基因过表达可能促进克隆扩增。值得注意的是，增加粘附和共刺激受体CD44的表达，可驱动上皮内CD8+TRM向更扩增的状态转变。TGF-β共受体TGFBR3的过表达也被预测能促进TRM特征，这与TGF-β信号是TRM分化和维持的核心要求一致。此外，细胞毒性颗粒酶基因和CCL5的表达减少，以及IL7R、RORA和NR4A1的表达增加，伴随着效应T细胞向肝脏TRM的转变。
研究方法概述
本研究的关键技术方法包括：从健康供体获取匹配的结肠、肝脏和外周血样本；通过酶消化和机械分离法从结肠组织和肝组织中分离免疫细胞，并使用流式细胞分选术富集CD45+CD3+T细胞；应用10x Genomics平台进行单细胞5‘ RNA测序和配对TCR（αβ链）测序；利用Seurat和Scanpy软件包进行单细胞数据质控、整合、降维、聚类和细胞类型注释；采用NicheNet进行细胞间通信配体-受体分析；使用Slingshot进行拟时序分析推断细胞状态转换；应用Geneformer进行体外基因扰动模拟预测关键调控因子；通过GLIPH2进行TCR序列基序和全局模式相似性分析；利用CoNGA（克隆邻域图分析）整合TCR序列和转录组数据评估克隆与表型关联。
研究结论与意义
这项研究通过构建同一供体肠道-肝脏-血液轴的T细胞单细胞图谱，深入揭示了组织驻留记忆T细胞的克隆架构和适应机制。研究发现，不同组织微环境塑造了独特的TRM转录程序和克隆扩增模式，上皮内、固有层和肝脏的TRM群体相对独立，克隆共享有限。局部细胞产生的配体，如整合素配体，可能通过信号调控影响TRM的表型和功能。计算模拟预测了多个可能驱动克隆扩增和组织适应的关键分子开关。这些发现不仅增进了我们对人体重要免疫界面T细胞适应性的理解，也为未来研究靶向组织驻留T细胞以治疗相关疾病（如炎症性肠病、肝脏疾病）提供了新的思路和潜在靶点。该研究建立的同一供体多组织分析范式和高通量计算方法，为免疫学研究提供了宝贵的资源和工具。
