犬瘟热病毒（CDV）属于麻疹病毒属（副黏病毒科），是一种高度传染性且常致命的多系统疾病（Bi等人，2015年；Rima等人，2019年）。它具有非分段的负链单链RNA基因组，编码六种结构蛋白，即核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大蛋白（L）以及两种非结构蛋白（C和V）（Rendon-Marin等人，2019年）。编码N蛋白的基因常被选为CDV核酸检测的目标区域（Fu等人，2016年；Wang等人，2017年；Xu等人，2012年），其变异程度较低（Ricci等人，2021年；Rima等人，1995年；Wipf等人，2025年）。CDV可通过直接接触或间接接触（如气溶胶传播和接触呼吸道及眼部分泌物）广泛感染犬科和鼬科的食肉动物，包括狗、水貂、狐狸和貉（Deem等人，2000年；Zhou等人，2024a）。据报道，它还能通过狗传播给许多野生食肉动物，如西伯利亚虎、埃塞俄比亚狼和其他濒危物种（Zhang等人，2017年），以及猎豹和狮子（Mourya等人，2019年；Zhang等人，2017年），被认为是多种家养和野生动物新的病毒风险（Seimon等人，2013年）。
由CDV引起的犬瘟热（CD）是一种在全球范围内发病率高且死亡率高的地方性疾病，在寒冷季节发病率更高（Karki等人，2022年；Martella等人，2008年）。在早期阶段，感染动物可能表现出非特异性临床症状，如厌食、抑郁、结膜炎和趾部角化过度。然而，疾病会发展为严重的呼吸系统、胃肠道和神经系统症状，导致多系统症状（Iribarnegaray等人，2024年）。在此过程中，动物的免疫系统也会受到影响，导致严重的免疫抑制，出现双相发热、咳嗽、腹泻和厌食等症状（Karki等人，2022年）。犬类的神经系统症状通常是致命的，幸存者会表现出持续的神经功能障碍，需要终生管理（Iribarnegaray等人，2024年）。因此，快速准确的CDV诊断方法对于及时识别亚临床携带者和在感染早期提供病因治疗至关重要，从而防止临床症状恶化并遏制病毒向易感宿主的传播。
虽然常规临床发现可以为CDV感染提供初步诊断支持，但由于无症状携带者的普遍存在以及感染动物在病毒早期阶段缺乏特异性临床表现，这些发现不足以进行确诊（Rivera-Martínez等人，2024年）。因此，实施经过验证和标准化的CDV诊断方法对于生成重要的流行病学数据以指导治疗策略、优化疫情控制方案和降低高密度犬群中的传播风险至关重要。传统的检测方法由于CDV的致病特性或检测方法的局限性，不适合快速、方便和准确的CD诊断。病毒分离虽然具有确诊能力，但耗时较长（数天至数周），不适合临床使用（Elia等人，2006年；Rivera-Martínez等人，2024年）。目前，如ELISA等血清学检测方法具有相对较高的灵敏度和特异性，但之前的疫苗接种和/或感染状态可能会影响检测结果（Egerer等人，2022年；Elia等人，2006年；Sarchahi等人，2022年）。相比之下，核酸检测方法可能是一种更可靠的检测方法，能够应对不同情况（Wang等人，2018年）。尽管逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）具有高灵敏度，但它们需要专用设备和受过培训的人员，限制了其在即时检测（POCT）中的应用（Becker等人，2024年；Hu等人，2022年；Zhou等人，2023年）。因此，迫切需要快速、无需设备且可在现场使用的诊断工具。
规律间隔的短回文重复序列簇和相关核酸酶（CRISPR-Cas）系统为快速和敏感的分子诊断提供了潜在应用（Chen等人，2018年；Gootenberg等人，2018年）。CRISPR-Cas系统是一种RNA引导的适应性免疫系统，可保护细菌和古菌免受外来核酸的入侵（Abudayyeh等人，2016年；Barrangou等人，2007年；Marraffini和Sontheimer，2008年）。CRISPR-Cas13a系统通过识别和检测目标RNA序列来激活Cas核酸酶的切割/降解活性，无差别地切割附近的单链RNA（ssRNA）。实验研究表明，CRISPR-Cas13a具有单碱基对识别能力（Gootenberg等人，2017年），这是保持核酸识别高准确性的关键特性。在检测系统中添加两端标记有荧光素或抗原的单链RNA作为报告分子，最终检测结果可通过qPCR仪器或侧向流动条带显示，肉眼可见。结合等温扩增步骤（如重组酶聚合酶扩增（RPA）/重组酶辅助扩增（RAA）技术，在37–42°C温度范围内扩增核酸，基于CRISPR-Cas13a的检测方法通常可以实现敏感和快速的检测过程（Zhang等人，2022年）。近年来，基于CRISPR-Cas系统的核酸检测技术在快速准确诊断主要人类和动物传染病方面取得了显著成功，如2019冠状病毒病（COVID-19）、丁型肝炎病毒（HDV）、戊型肝炎病毒（HEV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、禽流感病毒（AIV）、猴痘病毒和传染性胃肠炎病毒（TGEV）（Hu等人，2022年；Wang等人，2024a；Wang等人，2024b；Wu等人，2023年）。在本研究中，我们旨在建立一种结合RAA、侧向流动条带和CRISPR-Cas技术的新型平台，用于CDV RNA检测，该方法既准确又灵敏，操作快速简便，不再受操作者和设备的限制，有助于CD的治疗和预防。
我们开发了一种便携式的RAA-CRISPR-Cas13a检测方法，用于CDV RNA检测，整合了HUDSON技术（加热未提取的诊断样本以灭活核酸酶），可在1.5小时内使用qPCR仪器或侧向流动条带获得结果，提供了前所未有的速度、灵敏度和操作灵活性。这种方法在资源有限的环境或极端天气条件下尤其有价值，因为传统诊断方法在这种情况下不方便使用。
