七氟醚（Sevoflurane）会在雄性小鼠的突触发生（synaptogenesis）过程中引发持续性的类似自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder）的病理变化，而阿法克索隆（alphaxalone）则不会产生这种效应

该研究探讨新生期全身麻醉（GA）是否通过激活mTOR信号通路导致自闭症样行为。实验对比了两种GA（sevoflurane和alphaxalone）对小鼠神经发育的影响，发现sevoflurane导致长期ASD样行为、caspase-3激活及mTOR超激活，而alphaxalone无此效应，并通过rapamycin阻断mTOR可逆转sevoo的负面影响，提示神经类固醇GA可能更安全。

本杰明·沃尔沃维茨（Benjamin Volvovitz）|阿德雷·纽森（Adre Newson）|安杰尔科·米洛塞维奇（Andjelko Milosevic）|塔玛拉·蒂米克·斯塔梅尼奇（Tamara Timic Stamenic）|涅马尼亚·乌塞伊诺维奇（Nemanja Useinovic）|娜塔莉娅·米洛萨夫列维奇（Natalija Milosavljevic）|斯洛博丹·M·托多罗维奇（Slobodan M. Todorovic）|韦斯娜·耶夫托维奇-托多罗维奇（Vesna Jevtovic-Todorovic）

美国科罗拉多大学安舒茨医学校区麻醉学系，科罗拉多州奥罗拉市

摘要

背景与目的

早期全身麻醉（GA）可能会导致动物出现社会情感行为变化，并在人类中引发自闭症谱系障碍（ASD）。GA引发ASD症状的机制尚不清楚。我们研究了mTOR激活作为ASD的潜在原因。我们评估了新生儿暴露于挥发性麻醉剂七氟醚（sevoflurane）或注射型麻醉剂阿法沙隆（alfaxalone）后出现的类似ASD的病理变化。

实验方法

我们在出生后第7天（PND7）将雄性小鼠幼崽暴露于七氟醚或阿法沙隆（及其相应的溶剂）中6小时。在GA暴露后2小时对海马区的caspase-3活性进行了组织形态学分析，并在GA暴露后24小时对海马区的mTOR激活进行了Western blot分析。在GA暴露后4-6周评估了丘脑神经元的放电情况。成年后进行了类似ASD特征的行为测试，包括超声发声（USV）、巢穴破坏行为、大理石埋藏行为以及三室社交测试。

主要结果

与阿法沙隆不同，七氟醚导致更多的巢穴破坏/大理石埋藏行为，并使小鼠的社交偏好转向无生命物体。七氟醚处理后超声发声减少，而阿法沙隆处理后没有这种现象。七氟醚引起的行为变化伴随着caspase-3活性的增加、mTOR的过度激活以及神经元放电的增加。雷帕霉素（mTOR的负调节剂）可以显著逆转这些效应。

结论与意义

与七氟醚不同，阿法沙隆不会导致长期持续的ASD样行为，也不会影响mTOR的激活和组织形态，这表明阿法沙隆可能是比七氟醚更安全的替代品。

引言

根据众多临床前研究结果以及最新的临床观察，环境毒素（如全身麻醉剂）可能在脑发育的关键时期（突触形成期）导致人类行为改变。

虽然最初的研究集中在认知后遗症上，但后来发现早期全身麻醉暴露可能会导致动物出现社会情感行为改变，并在人类中引发自闭症谱系障碍（ASD）。得益于过去十年中非人类灵长类动物的研究，我们知道焦虑和恐惧相关行为（尤其是在新的社交环境中）以及成年后的亲和/顺从行为较为常见，这些都与啮齿动物模型中观察到的社会情感障碍相似。

过去几十年里，我们和其他研究者发现，早期全身麻醉暴露会导致动物出现类似ASD的生理、形态学和功能变化。例如，年轻啮齿动物暴露于全身麻醉剂后，社交互动减少，与母亲的交流减少，对新奇事物的兴趣降低。此外，形态学异常包括树突分支的增加和复杂性提高、神经元凋亡，以及突触连接的功能障碍和兴奋/抑制失衡。

目前，关于全身麻醉引发类似ASD症状的机制仍存在知识空白。特别重要的是，mTOR信号通路的过度激活（如雷帕霉素所示）被认为是许多临床形式的ASD的致病机制之一。这可能与mTOR在脑发育过程中调节细胞增殖、生长、代谢和自噬的作用有关。

与常见的全身麻醉剂（包括七氟醚）不同，我们最近的研究表明，这类神经活性类固醇不仅没有神经毒性，而且不会导致认知损伤。这促使我们提出两个问题：1）像阿法沙隆这样的典型神经活性类固醇麻醉剂是否也不会导致长期的社会情感障碍？2）七氟醚引起的ASD样病理是否至少部分是由于mTOR通路过度激活？如果是这样，那么在阿法沙隆暴露后mTOR通路是否会过度激活？

我们的研究结果表明，与新生儿七氟醚暴露不同，阿法沙隆暴露不会导致长期持续的ASD样行为，也不会影响mTOR通路的激活和组织形态，这表明在脑突触形成高峰期使用阿法沙隆可能比七氟醚更安全。

实验部分

实验动物

成年CD-1雌性小鼠及其雄性幼崽购自Charles River Laboratories（美国马萨诸塞州威尔明顿）。小鼠幼崽在出生后第4天（PND4）被捕获，并与母鼠一起饲养直至实验开始。所有实验均获得了科罗拉多大学安舒茨医学校区动物护理和使用委员会的批准。实验操作符合公共卫生服务关于实验室动物人道护理和使用的政策。

早期暴露于常规全身麻醉剂七氟醚会导致成年小鼠出现长期持续的ASD样行为

为了了解在脑发育高峰期（PND7）暴露于七氟醚的小鼠的ASD样行为，我们重点研究了四种在啮齿动物中广泛使用的社会情感行为测试：巢穴破坏行为（A）和大理石埋藏行为（B）（这两种行为被认为是强迫行为的模型），三室社交测试（C）（用于研究社交互动和对新奇事物的兴趣），以及超声发声（USV）（D）（用于研究啮齿动物的社交能力）。

讨论与结论

本研究结果表明，当小鼠在脑发育高峰期暴露于七氟醚时，社会情感行为以及ASD特征性的组织形态和功能障碍是长期存在的。重要的是，我们发现神经活性类固醇麻醉剂阿法沙隆在脑发育高峰期使用时不会引发任何ASD样病理变化。

作者贡献声明

娜塔莉娅·米洛萨夫列维奇（Natalija Milosavljevic）：数据整理。韦斯娜·耶夫托维奇-托多罗维奇（Vesna Jevtovic-Todorovic）：撰写初稿、监督、资金获取、概念构思。斯洛博丹·M·托多罗维奇（Slobodan M. Todorovic）：撰写初稿、监督、方法设计、资金获取、数据分析、概念构思。本杰明·沃尔沃维茨（Benjamin Volvovitz）：撰写初稿、方法设计、实验实施、数据分析。安杰尔科·米洛塞维奇（Andjelko Milosevic）：数据整理。阿德雷·纽森（Adre Newson）：数据整理。涅马尼亚·乌塞伊诺维奇（Nemanja Useinovic）：数据整理。

利益冲突声明

无。

资助

本研究由NIH/GMS—R01GM123746（资助V.J.-T.）、CU Medicine Endowment（资助V.J.-T.）、麻醉学系启动资金（资助V.J.-T.）、NIH/GMS—R35GM141802（资助S.M.T.）、VA Merit 1I01BX004763（资助S.M.T.）和NIH-NIDA-K01 DA055258（资助T.T.S.）提供支持。B.V. 是NIH T32研究员（T32GM135169）（资助V.J.-T.）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢Doug Covey博士在实验过程中提供的阿法沙隆和宝贵指导，同时感谢Vasilije Tadic博士提供的初始膜片钳记录数据。