HLA-B∗51:01特异性免疫肽组在白塞病中的免疫致病作用

HLA-B∗51:01等位基因通过调控免疫肽组激活T细胞并分泌促炎因子（如TNF-α、IL-17A），在贝赫切特病（BD）中起关键致病作用。研究比较了BD患者与HLA-B∗51:01阳性健康对照者的免疫肽谱，发现BD特异性肽（如偏好疏水性氨基酸）和BD优势肽（含量显著升高）可激活CD8+ T细胞，诱导NETosis及组织损伤。该成果首次阐明HLA-B∗51:01免疫肽组特征及其病理机制，为BD的靶向治疗提供新思路。

李叶姬|赵庆朝|赵秉圭|金素贤|朴俊元|申东进|金钟一|姜仁秀|李宇根|李恩邦

韩国首尔国立大学医学院内科风湿病学系

摘要

目的

免疫肽组（即与人类白细胞抗原（HLA）结合的肽的集合）在引发免疫反应中起着关键作用。HLA-B∗51:01是一个与贝赫切特病（BD）相关的等位基因。然而，与HLA-B∗51:01结合的免疫肽组在BD发病机制中的作用仍不清楚。

方法

我们使用HLA-B∗51:01阳性的BD患者和健康对照者的血浆样本来分析HLA结合的免疫肽组。通过免疫沉淀法分离HLA-I类分子，并利用液相色谱-串联质谱技术比较HLA-B∗51:01阳性BD患者与健康对照者之间的HLA结合肽。然后通过NetMHCpan结合预测软件筛选出潜在的HLA-B∗51:01结合肽和T细胞表位。通过酶联免疫斑点试验、流式细胞术和葡聚糖染色等方法研究这些肽的免疫原性。

结果

我们采用两种不同的方法分析了BD患者的免疫肽组。首先，我们鉴定出了BD特异性肽。在8008种肽中，有2306种仅存在于BD患者中。BD特异性免疫肽组在肽的第2位偏好疏水性氨基酸。外显子测序证实了这些代表性肽的存在。当这些肽在HLA-B∗51阳性BD患者的单核细胞来源的树突状细胞上呈现时，能够有效激活T细胞，使其分泌促炎细胞因子并表达脱颗粒标志物CD107a。此外，我们还鉴定出在BD中含量增加的BD特异性肽。这些肽同样能激活T细胞，导致促炎细胞因子的分泌。

结论

HLA-B∗51阳性BD患者体内的免疫肽组与HLA-B∗51阳性健康对照者不同，能够激活T细胞并分泌促炎细胞因子；这可能参与了BD的发病机制。

引言

贝赫切特病（BD）是一种多系统自身炎症性疾病，其特征是反复发作的口腔溃疡、生殖器溃疡、葡萄膜炎和特征性皮肤病变[1,2]。遗传倾向和环境因素（包括细菌和病毒）在BD的发病中起着重要作用。在BD的遗传风险因素中，主要组织相容性复合体（MHC），尤其是人类白细胞抗原（HLA）B∗51:01，在不同种族群体中被认为是最强的关联因素[1,[3], [4], [5]]。HLA-B分子中第97、116、152和67位点的多态性显著且独立地增加了BD的风险[6]。其他研究表明，HLA-B∗51可以通过与CD8⁺ T细胞上表达的自然杀伤细胞受体相互作用来影响T细胞[7,8]。然而，HLA-B∗51:01在BD中的致病机制尚未完全明了。

活动性BD患者的CD8⁺ T细胞比非活动性BD患者或健康对照者更多；这一现象仅在HLA-B∗51阳性BD患者中观察到，而在HLA-B∗51阴性BD患者中则未见[8,9]。BD皮肤病变中的CD8⁺ T细胞分泌IL-17A，从而招募中性粒细胞，导致NETosis和组织损伤[10]。最近的研究发现，ERAP1的功能丧失会影响HLA-B*51阳性BD患者中肽的长度（超过9个氨基酸），进而影响其对CD8⁺ T细胞的免疫原性[11]。这一发现表明，HLA-B*51阳性BD患者的免疫肽组可能与其他HLA类型的BD患者不同，可能参与了BD的发病机制[11]。CD8⁺ T细胞分泌的细胞因子在BD的发病机制中也起着关键作用。BD患者的外周血单核细胞（PBMCs）和房水中IFN-γ水平升高[12]，并且抗TNF-α治疗对BD有效[2,14]。当这些细胞因子通过抗原呈递由活化的淋巴细胞分泌时，会激活先天免疫反应、早期中性粒细胞浸润组织以及后期适应性免疫，最终导致BD[15]。

免疫肽组是由特定MHC分子呈递给T细胞的抗原肽的集合[[16], [17], [18]]。在一些自身免疫性疾病中，免疫肽组的作用正在被逐渐揭示。HLA-B*27:05是强直性脊柱炎（AS）的最相关风险因素，它可以呈递自身致关节炎肽并激活AS患者的CD8⁺ T细胞[19]。在1型糖尿病（T1D）中，已经从T1D患者的B细胞中鉴定出HLA-I和HLA-II免疫肽，并与健康对照者进行了比较，表明这些肽可能参与其中[20]。尽管HLA-B*51与BD之间存在密切关系，但关于BD患者免疫肽组的研究却很少。

在本研究中，我们利用质谱技术探讨了HLA-B*51阳性BD患者的免疫肽组，并研究了提取肽的免疫学特性，特别是其激活患者T细胞的能力。

样本收集和临床信息

共有20名HLA-B*51阳性BD患者和18名健康对照者参与了研究。参与者的详细临床信息列于表1中。本研究方案已获得韩国首尔国立大学医院的机构审查委员会批准，并获得了所有参与者的知情同意。HLA分型由GC Biopharma（韩国龙仁）完成。

血浆和外周血单核细胞的分离

血浆来自外周血。

从BD患者和健康对照者的血浆中鉴定HLA-B*51:01免疫肽组

我们对血浆中的HLA-I肽谱进行了分析，并从20名HLA-B*51阳性BD患者和18名HLA-B*51阳性健康对照者的血液中提取了基因组DNA，并进行了外显子测序（图1A）。临床特征总结在表1中。使用抗HLA-I抗体通过免疫沉淀法分离了HLA-I分子和肽。也使用了同型匹配的抗体作为对照。

讨论

本研究建立了HLA-B*51阳性BD患者的免疫肽组，并揭示了该免疫肽组使T细胞分泌BD相关促炎细胞因子的能力。据我们所知，这是首次报道HLA-B*51阳性BD患者的免疫肽组，并将其与HLA-B*51阳性健康对照者和HLA-B*51阴性BD患者的免疫肽组进行比较。

这里，免疫肽组是从血浆中而不是细胞中提取的。

作者贡献声明

李叶姬：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据可视化，方法学研究，数据管理。赵庆朝：撰写 – 初稿，数据可视化，方法学研究，撰写 – 审稿与编辑。赵秉圭：验证，方法学研究，研究。金素贤：验证，方法学研究，研究。朴俊元：监督。申东进：研究。金钟一：监督。姜仁秀：撰写 – 审稿与编辑。李宇根：撰写 – 审稿与

资助

本研究得到了韩国国家研究基金会通过基础科学研究计划（由教育部资助，项目编号：2016R1D1A1A02937044）的支持，以及韩国健康产业发展研究所（KHIDI）通过韩国健康技术研发项目（由韩国卫生与福利部资助，项目编号：RS-2025-02215880）的资助。

利益冲突声明

EB Lee从Boehringer Ingelheim获得了演讲费用。其他作者没有需要声明的利益冲突。

致谢

我们感谢韩国科学技术院生物医学研究所诊断中心的Ki-Cheol Han博士为本研究提供的关于免疫沉淀技术的宝贵见解。