PH0140的晶体结构：外源氨基酸诱导八聚体组装的形成，从而实现PromoterTTTT的结合，进而调控转录过程

PH0140蛋白通过结合外源色氨酸和异亮氨酸形成寡聚体并调控DNA结合及转录，其结构特征及分子机制通过X射线晶体学、ITC和分子动力学模拟揭示。

理查德·马里亚达塞（Richard Mariadasse）| 穆罕默德·艾哈迈德（Mohammed Ahmad）| 拉维·坎特·帕尔（Ravi Kant Pal）| 科希拉·古鲁纳坦（Kohila Gurunathan）| 斯内哈·苏布拉马尼安（Sneha Subramaniyan）| 比奇特拉·K·比斯瓦尔（Bichitra K. Biswal）| 苏雷什·库马尔·穆图维尔（Suresh Kumar Muthuvel）| 斯大林·坦布斯萨米（Stalin Thambusamy）| 杰亚卡坦南·杰亚拉曼（Jeyakanthan Jeyaraman）

印度泰米尔纳德邦阿拉加帕大学（Alagappa University）生物信息学系

摘要

PH0140是一种来自Pyrococcus horikoshii OT3中的Feast/Famine Regulatory Protein (FFRP)家族的假想蛋白，据预测它在响应外源性氨基酸时参与转录调控。先前的计算机模拟研究表明，PH0140对外源性色氨酸具有结合偏好，并通过DNA识别和别构作用来调节转录。然而，其结构和调控机制在很大程度上仍不为人所知。在这项研究中，我们确定了PH0140的晶体结构，分辨率为2.0 Å，发现它通过独特的结构特征与外源性异亮氨酸结合：一个位于效应器结合域（EBD）附近的C端环区以及一个与同源蛋白有显著结构差异的β链（β4）。尺寸排阻色谱法显示，在存在外源性异亮氨酸和色氨酸的情况下，PH0140会形成寡聚体。此外，还通过等温滴定量热法（ITC）表征了氨基酸的结合情况。研究结果表明，外源性色氨酸的结合亲和力高于异亮氨酸。为了探索这种配体效应的结构基础，我们模拟了一个包含111 bp启动子片段的PH0140–DNA复合物，并进行了多次分子动力学模拟。模拟结果显示，八聚体组装会通过构象变化与DNA启动子^TTTT区域相互作用。EBD上的疏水驱动力导致β链（β4）发生扭曲，形成环状结构（Chain G），从而便于与启动子^TTTT区域相互作用，实现转录调控。

引言

亮氨酸响应性调节蛋白（Lrp）/天冬酰胺合成酶C蛋白（AsnC）家族的成员是广泛存在于原核生物（包括细菌和古菌）中的全局或特异性转录调节因子，在氨基酸代谢、运输及其他相关生物过程中起着重要作用1, 2, 3。其中最被充分研究的成员是大肠杆菌的Lrp，它调控多个基因和操纵子，包括一些参与氨基酸代谢的基因4, 5。根据外源性亮氨酸与Lrp的结合情况，代谢会在“丰饶”和“饥荒”模式之间切换。因此，这类转录因子被称为Feast/Famine Regulatory Protein (FFRP) 2, 5, 6，其分子量约为15 kDa，主要由两个结构域组成：N端的螺旋-转角-螺旋（HTH）DNA结合域和C端的效应器结合（或调控）域，两者通过一个灵活的铰链区域连接[7]。调控域也被称为独立氨基酸代谢调控（RAM）域，具有αβ-三明治（βαββαβ）折叠结构。RAM域与天冬氨酸激酶、Chrismate突变酶和TyrA（ACT）域非常相似，这些域是许多代谢酶中普遍存在的小分子结合和别构调控域8, 9。RAM域包含I型和II型活性位点口袋。外源性氨基酸在II型位点的结合调节转录机制，而在I型位点的结合则通过别构作用下调转录[10]。例如，色氨酸与色氨酸响应性调节蛋白（TRP）的效应器结合域的结合会改变蛋白质-DNA复合物的结合亲和力，从而影响转录是激活还是抑制[2]。Lrp/AsnC家族的蛋白质在溶液中会形成更高阶的寡聚体。这种寡聚体组装受外源性氨基酸与apo-蛋白质结合的调控[2, 11]。例如P. furiosus的LrpA、大肠杆菌的AsnC、枯草芽孢杆菌的LrpC和结核分枝杆菌的H37Rv (Rv2779c分别形成二聚体、八聚体、十二聚体和十聚体[12, 13]。已经确定了几种含有外源性氨基酸和DNA分子的FFRP晶体结构。早先也有报道指出，某种外源性氨基酸诱导了FFRP的八聚体组装（PDB ID: 2GQQ）[14]。FFRP通常在TTTT或AAAA双链启动子区域结合以实现转录调控，改变其中任何一个碱基会减弱复合物的结合亲和力或分子相互作用[6]。尽管已经收集了大量蛋白质结构数据，但FFRP家族中外源性氨基酸结合引起的分子机制、寡聚体形成及构象变化仍很大程度上未知。我们对PH0140进行了广泛的计算分析，包括对接和分子动力学模拟。结果强烈表明，色氨酸表现出更高的对接分数，并通过别构网络通信来调节转录[2]。因此，我们试图通过实验验证色氨酸的结合以及PH0140的转录调控作用。在本研究中，我们利用X射线晶体学和生物物理学及分子建模技术阐明了Pyrococcus horikoshii OT3中PH0140（FFRP）的结构、结合特异性、寡聚体形成及构象变化。

PH0140蛋白的序列比对、克隆、表达和纯化

PH0140被归类为一种未表征的HTH型转录调节因子。序列比对显示，它与几种FFRP具有38%的平均序列同源性[2]。因此，FFRP/亮氨酸响应性调节（LRP）蛋白家族通过形成更高阶的寡聚体参与转录调控。我们克隆了带有C端六组氨酸标签的PH0140基因，插入pET30a+载体中

外源性氨基酸诱导的PH0140寡聚体形成

GFC分析用于阐明在异亮氨酸和色氨酸等外源性氨基酸存在下PH0140的结构变化或寡聚体形成情况。由于异亮氨酸在体内就与PH0140结合，因此形成了更高阶的寡聚体，这一点在GFC谱图中得到了证实。为了准确测定分子量，添加了标准分子量标记物以精确校准洗脱体积。

PH0140蛋白与野生型和突变型启动子区域的结构稳定性及潜在相互作用

PH0140蛋白与启动子^TTTT和启动子^GGGG复合物的结构稳定性不同。启动子^TTTT-PH0140复合物的均方根偏差（RMSD）和均方根波动（RMSF）值分别在0.15-0.25 nm（补充图3）和0.1-0.25 nm范围内。PH0140蛋白的A链残基的波动幅度大于B链。在启动子^GGGG-PH0140复合物中，RMS偏差和RMS波动

DNA-PH0140-异亮氨酸和PH0140-色氨酸氨基酸复合物的分子动力学模拟

进行了DNA-PH0140蛋白与异亮氨酸和色氨酸氨基酸结合的生物复合物的分子动力学模拟，以了解寡聚体形成和转录调控机制（图8）。在DNA-PH0140-异亮氨酸和色氨酸复合物中，平均RMS偏差值分别在0.05-1.5 nm和0.05-1.0 nm范围内，这表明DNA-PH0140-色氨酸复合物在100 ns的时间内相对稳定（补充图8）。

讨论

PH0140蛋白的结构

PH0140蛋白的序列比对、克隆、表达和纯化

PH0140蛋白的序列来自Pyrococcus horikoshii OT3，从UniProtKB数据库（访问号：O57880）中获取[17]。使用BlastP搜索非冗余蛋白质序列，识别出不同生物体中的同源蛋白，有助于蛋白质家族的分类[18]。使用ClustalW序列比对网站分析这些同源蛋白之间的序列相似性和氨基酸组成[19]。结构相似性通过EsPript软件展示

数据收集

X射线衍射实验使用的是内部X射线旋转阳极衍射仪（SuperBright波长CuKα，1.54 Å；CrKα，2.29 Å），在新德里的国家免疫学研究所进行。用尼龙环快速将单晶取出，浸入冷冻保护溶液中，然后安装在液氮流冷却下的测角仪头上，温度为100 K。冷冻保护溶液由25 µl 100%乙二醇和75 µl储液组成

PH0140蛋白的结构确定、精修、模型构建和验证

利用Pyrococcus horikoshii OT3中的PH1519（PDB ID：2CYY）的晶体结构，通过分子替换法确定了PH0140的晶体结构，两者具有38%的序列同源性。使用CCP4-Phaser程序进行结构精修，得到一个不对称单元中的单个分子模型。该模型经过50轮刚性体精修，随后进行100轮基于最大似然的坐标精修

尺寸排阻色谱

通常情况下，PH0140蛋白的同源物在外源性氨基酸存在下会形成更高阶的寡聚体。在此实验中，使用含有20 mM Tris（pH 7.0）、50 mM NaCl和4 mM DTT（二硫苏糖醇）的缓冲液平衡色谱柱。将PH0140蛋白（2 mg/ml）以及外源性氨基酸异亮氨酸和色氨酸（5 mM）孵育30分钟后，加载到预平衡的色谱柱中，通过尺寸排阻色谱法研究蛋白质的寡聚体形成

等温滴定量热（ITC）分析

等温滴定量热（ITC）可以准确测量蛋白质-配体相互作用建立过程中释放/吸收的热量，以及解离/结合常数（Kd/Ka）、焓（ΔH）、熵（ΔS）、反应化学计量（n）和蛋白质-配体复合物的结合自由能（ΔG）等热力学参数[29]。在ITC实验前，所有样品都经过过滤和脱气处理。实验中使用的PH0140浓度为100 µM（在50 mM Tris pH 8.0和50 mM NaCl溶液中）

电泳迁移率测定（EMSA）

对于DNA结合实验，将纯化的蛋白质与20-bp双链DNA探针孵育，该探针由5′-FAM标记的前导寡核苷酸与其未标记的互补链组成。EMSA反应在最终体积为20 μL的缓冲液中进行，缓冲液含有10 mM Tris（pH 7.5）、50 mM NaCl、1 mM DTT和5%甘油以及0.05 mg/mL BSA，蛋白质浓度范围为1 μM至5 μM。反应在25 °C下孵育超过30分钟

CRediT作者贡献声明

理查德·马里亚达塞（Richard Mariadasse）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学研究、数据管理、概念构思。穆罕默德·艾哈迈德（Mohammed Ahmad）：可视化处理、验证、正式分析、数据管理。拉维·坎特·帕尔（Ravi Kant Pal）：验证、正式分析。科希拉·古鲁纳坦（Kohila Gurunathan）：方法学研究、正式分析。斯内哈·苏布拉马尼安（Sneha Subramaniyan）：方法学研究、正式分析。比奇特拉·K·比斯瓦尔（Bichitra K. Biswal）：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督。苏雷什·库马尔·穆图维尔（Suresh Kumar Muthuvel）：撰写 – 审稿与编辑

伦理批准和参与同意

不适用

数据和材料的可用性

蛋白质结构已存储在蛋白质数据库中，PBD ID为7FBY（PDB DOI：10.2210/pdb7FBY/pdb）。本研究生成的所有数据集均包含在文章/补充材料中。

作者贡献

R.M负责整个研究的設計和实施。RKP和MA负责数据收集、处理和结构解析。KG和SS负责蛋白质纯化，BKB、SKM和ST分别指导他们的研究工作。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务或个人利益冲突，这些冲突可能会影响本研究的结果。

致谢

JJ衷心感谢生物技术-生物信息学中心（BIC）-No.BT/PR40154/BTIS/137/2021、DBT-NNP-No.BT/PR40156/BTIS/137/54/2023、TANSCHE（文件编号RGP/2019-20/ALU/HECP-0049）以及DST Indo-Taiwan（GITA/DST/TWN/P-86/2019）通过重大研究项目提供的财政支持。作者还感谢DST-FIST（SR/FST/LSI-667/2016，新德里）提供的基础设施支持。作者同时感谢新德里科学技术部的支持