从Bacillus velezensis中提取碱性蛋白酶，并对其进行工艺优化及放大生产，以提升黑水虻在生物转化过程中的效果

本研究利用Bacillus velezensis生产碱性蛋白酶，通过热碱处理改善禽类屠宰废物的可生物降解性，减少细菌污染，提高黑水虻幼虫转化效率，最终实现废物资源化并降低处理成本。

拉查娜·D·夏尔马 | 普拉布·坦加杜赖

印度泰米尔纳德邦哥印拜陀皮拉梅杜PSGR克里希纳马尔女子学院生物技术系

摘要

富含蛋白质的家禽屠宰场废弃物（PSW）是一种成分复杂的底物，限制了黑水虻（Hermetia illucens，简称BSF）幼虫的有效生物转化。本研究报道了从Bacillus velezensis中现场生产碱性蛋白酶，并将其用于PSW的热酶处理。性能与仅采用热处理的对照组以及活性相当的商用蛋白酶（酪蛋白–Folin单位）进行了对比。通过响应面分析法确定了酶生产的最佳条件为pH 9.5、温度55°C和反应时间36小时，在10升搅拌罐生物反应器中可产酶量达到6.2 ± 0.1 U mL⁻¹。脱盐后的硫酸铵浓缩物（P1）的比活性为50.7 ± 3.0 U mg⁻¹蛋白质，并在冻干后仍保持96 ± 3%的活性。将P1以150 U g⁻¹的浓度在pH 8.5和60°C下应用于湿PSW中，120分钟后水解程度达到18%。处理后卫生状况得到改善，总需氧菌数量减少了3.8 log₁₀ CFU g⁻¹，大肠菌群/E. coli数量低于1.0 log₁₀ CFU g⁻¹，未检测到Salmonella。与未经处理的PSW相比，蛋白酶处理使废弃物减少量增加了79.4%，生物转化效率提高了39.8%，废弃物减少指数达到了6.62% d⁻¹，干物质饲料转化率降至2.51（所有结果均< p < 0.001）。实验结果与商用蛋白酶相当，甚至优于仅采用热处理的对照组。处理后的幼虫粗蛋白含量达到45.8%，ΣEAA₉值为45.11 g 100 g⁻¹蛋白质。搅拌罐生产酶的过程显示出可扩展性，未来的工作将致力于降低酶的成本和60°C步骤所需的能源消耗，以实现更高吞吐量的应用。

引言

蛋白酶是一种普遍存在的酶，能够水解蛋白质中的肽键，广泛应用于洗涤剂、食品加工、皮革脱毛和环境技术中（Alamnie等人，2023年；Martinusen等人，2025年；Ramakodi等人，2020年）。在这些生物催化剂中，碱性蛋白酶特别具有吸引力，因为它们在碱性环境中仍能保持活性，并且在较高温度下也能保持操作稳定性（Barzkar，2020年；Majithiya等人，2025年）。微生物发酵是生产蛋白酶的首选方法，因为它成本低、分泌量高且易于放大。在工业生产中，Bacillus subtilis复合菌株因其能够分泌耐高pH值和表面活性剂的胞外亚丁酶型碱性蛋白酶而被广泛使用（Amin等人，2025年；Anand等人，2025年；Contesini等人，2018年；Majeed等人，2024年）。特别是B. subtilis和B. licheniformis等Bacillus物种，由于其强大的胞外分泌能力和可靠的放大性能，被广泛用作商用碱性蛋白酶的生产宿主。Bacillus velezensis作为这一组中的代表菌株，具有出色的分泌能力、明确的遗传特性以及安全使用的记录（Humaira等人，2024年）。作为Bacillus subtilis复合菌株的一员，它在碱性条件下表现稳定，非常适合用于生产用于废弃物处理的蛋白酶制剂（Bilal等人，2024年）。

在肉类加工过程中，对这类酶的需求与废弃物的规模和复杂性密切相关。屠宰和加工过程中会产生血液、内脏、边角料、羽毛以及高浓度废水。这些废弃物含有较高的化学需氧量（COD）、生化需氧量（BOD）、水分和总凯氏氮（TKN），同时还含有悬浮脂肪和纤维（Jiménez-Urpi等人，2025年；Ramakodi等人，2020年）。它们可能还含有重金属、兽药残留物和激素活性化合物（Ashilenje等人，2026年）。如果未经处理直接排放，这些废弃物会导致异味、水体富营养化、病原体传播和温室气体排放（Shanmugam等人，2025年）。许多设施仍依赖简单的末端处理方法，虽然可以暂时减轻处理压力，但回收的价值很低，且无法消除根本的环境问题（Ashilenje等人，2026年）。在印度等快速增长的经济体中，这一问题尤为严重。过去十年中，全国肉类产量从约6.7 × 10⁶吨/年增加到10.3 × 10⁶吨/年，其中大部分在基础设施不完善的屠宰场和肉联厂进行处理（Ragasri和Sabumon，2023年）。副产品通常占活重的20–30%，因此约有2.0–3.1 × 10⁶吨/年的富含蛋白质的废弃物未被充分利用（Shanmugam等人，2025年）。不完善的处理流程、过时的操作方式和非正规的操作方式导致了局部污染问题的加剧（Awojobi和Richard-Omole，2024年）。因此，迫切需要开发适合当地基础设施的可扩展、低碳的废弃物转化方法，同时回收其中的营养价值。

在这种寻找循环经济解决方案的过程中，黑水虻（BSF）的生物转化技术提供了一个有前景的途径。Hermetia illucens的幼虫可以在多种有机底物上生长，在控制条件下通常能在8–18天内实现60–80%的废弃物减少（Bajra等人，2025年；Sharma等人，2025年；Sharma和Thangadurai，2025年；Siddiqui等人，2024b）。幼虫积累的蛋白质和脂质可以用于水产饲料或家禽饲料，部分替代鱼粉或豆粕（Chen等人，2024年；Siddiqui等人，2024a）。符合卫生和污染物标准的残留粪便可以用作有机土壤改良剂（Meza Elguera等人，2025年；Woo等人，2024年）。工艺性能通常通过质量减少和饲料转化为生物量的指标来评估，这些指标有助于工程分析和放大（Bohm等人，2022年；Siddiqui等人，2024b；Surendra等人，2020年）。然而，BSF生物转化的效果很大程度上取决于底物的性质，而家禽屠宰场废弃物（PSW）的特殊性使其处理难度较大。PSW含有内脏、边角料以及富含胶原蛋白的结缔组织，这些成分难以被水解（Shanmugam等人，2025年）。含血红素的成分会引入氧化还原活性物质，乳化脂肪会增加粘度，影响幼虫在饲养床中的呼吸和活动（Mlambo等人，2023年；Niranjan等人，2024年）。因此，废弃物减少率（WR）和生物转化率（BCR）往往下降，干物质饲料转化率（FCR）变差，卫生控制也比处理更均匀的食品废弃物或植物基底物更加困难（Bohm等人，2022年；Siddiqui等人，2024c）。在禽类加工是主要废弃物来源且污水处理能力有限的地区，这种问题尤为突出。因此，有必要采取预处理策略来改善PSW的性质。

为了解决这一问题，酶处理为像PSW这样的高蛋白质废弃物提供了一种比单纯热处理更有效的选择。碱性蛋白酶处理可以增加游离氨基氮（FAN）和水解程度（DH，%），破坏不溶性蛋白质结构，降低浆液粘度，并在中等温度和碱性条件下增强微生物的灭活效果（Majithiya等人，2025年）。这种热酶处理方式与工业用碱性蛋白酶兼容，有望生成更易于幼虫摄取和吸收的底物（Bilal等人，2024年；Ramakodi等人，2020年）。在基于昆虫的系统中，酶辅助处理主要针对木质纤维素材料和混合食品废弃物（Arnone等人，2022年；Lopes等人，2024年）。在屠宰场废弃物转化方面，目前的研究更多集中在油化、堆肥、厌氧消化和热化学处理上，这些方法主要目的是回收能量或生产低价值肥料（Jiménez-Urpi等人，2025年）。关于控制性碱性蛋白酶预处理对PSW生物转化效果和幼虫蛋白质质量的影响，目前仍缺乏足够的研究。

本研究旨在通过使用PSW作为模型底物和Bacillus velezensis产生的碱性蛋白酶作为处理剂来解决这一空白。研究评估了蛋白酶辅助处理是否能够提高底物的可利用性和卫生状况，并进一步探讨这些改进是否能够提升BSF的生物转化效果和幼虫蛋白质质量。结果与仅采用热处理的对照组以及活性相当的商用蛋白酶进行了对比。因此，本研究的目标是：（i）开发并放大Bacillus velezensis生产碱性蛋白酶的工艺；（ii）量化热碱处理对PSW物理化学和微生物特性的影响；（iii）确定这些变化如何影响固定饲养密度下的BSF生物转化效果和幼虫蛋白质质量。整个研究流程如图1所示，所有操作和分析细节详见“材料与方法”部分。

部分内容摘录

蛋白分解菌的选择性分离和分子鉴定

从印度泰米尔纳德邦哥印拜陀Singanallur的一个长期屠宰场废弃物处理场地采集了0至10厘米深度的复合土壤样本。在一次采样过程中（单日）收集了三个独立的复合土壤样本（每个200–300克）。每个样本均无菌转移到聚丙烯袋中，用冰块运输，并在24小时内进行处理。对土壤进行了物理化学和生物学特性分析（如pH值、水分等）。

基于16S rRNA的选择性分离和鉴定

对长期屠宰场废弃物场地土壤进行酪蛋白分解筛选后，在脱脂牛奶琼脂上发现了三种不同的菌落形态：一种形成边缘不规则的干燥乳状菌落；另一种形成边缘光滑的湿润灰色至灰白色菌落；第三种形成表面有光泽且偶尔出现淡绿色的透明菌落。通过重复实验测量了菌落直径与晕圈直径的比例。

结论

本研究表明，将Bacillus velezensis产生的碱性蛋白酶与黑水虻（BSF）的生物转化结合使用，可以提高富含蛋白质的家禽屠宰场废弃物的处理效果和产品质量。在pH 8.5和60°C下的热碱预处理增加了游离氨基氮含量，并使总需氧菌数量减少了约3.8 log₁₀ CFU g⁻¹。这些生化上的改进带来了更高的废弃物减少率（79.4% vs 64.3%）和更低的干物质饲料转化率。

CRediT作者贡献声明

拉查娜·D·夏尔马：负责撰写初稿、方法设计、实验实施、数据分析及数据整理。普拉布·坦加杜赖：负责修订和编辑、结果可视化、实验监督及概念框架的构建。

利益冲突声明

无。

致谢

本研究主要由GFFCO Global Private Limited资助，用于从生物反应器到Hermetia illucens的应用研究。初步分离株筛选和RSM优化工作得到了BIRAC EYUVA创新奖学金（项目编号：BT/IF0036/01/22）的支持，该奖学金由拉查娜·D·夏尔马获得。我们感谢Anupa Velusamy女士（Kovai BSF）提供Hermetia illucens幼虫，并在幼虫处理和放大相关技术方面给予指导。