1 引言
高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）与宫颈癌发生的关联性发现已广泛应用于国家筛查和免疫接种计划，并显著降低了宫颈癌死亡率。然而，在许多中等收入国家，宫颈癌的发病率和相关死亡率仍然很高。拉脱维亚是欧洲宫颈癌发病率和死亡率最高的国家之一，这不幸地伴随着相对较低的筛查率以及HPV疫苗的低接受度和接种率。
大规模HPV免疫接种已被证明会导致HR-HPV基因型流行率发生变化，即疫苗靶向基因型的流行率下降，而非疫苗基因型的流行率上升。多项研究表明，HPV16/18的流行率下降，而其他HR-HPV基因型，特别是未包含在HPV疫苗中的基因型，其流行率有所增加。虽然模拟模型研究表明，已进行的流行病学研究可能不足以检测非疫苗基因型流行率的真实变化，真实变化可能要在疫苗接种引入10多年后才能观察到，但所谓的“基因型替换”现象在全球范围内于大规模疫苗接种开始后几年内即有报道。这凸显了对HR-HPV基因型流行率变化进行动态监测的极端重要性，这些数据对于指导国家和全球HPV疫苗接种工作至关重要。
在拉脱维亚，HPV疫苗接种于2010年引入，使用针对HPV16和18的二价疫苗Cervarix。2020年，拉脱维亚引入了九价疫苗Gardasil 9，针对HPV6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52, 和58。迄今为止，在拉脱维亚人群中进行的HR-HPV流行率研究主要基于接受常规筛查女性的宫颈涂片样本。尚无研究监测女性宫颈疾病患者中HR-HPV基因型随时间的变化。本研究旨在调查宫颈 dysplasia（CD）和宫颈鳞状细胞癌（CSCC）病例宫颈组织中HR-HPV基因型流行率及病毒载量，将其与疾病严重程度相关联，并评估基因型流行率随时间的变化情况。
2 材料与方法
2.1 患者与样本
本研究基于里加斯特拉迪什大学伦理委员会颁发的伦理许可进行。研究评估了2016年至2024年间从Pauls Stradins临床大学医院档案中收集的一组福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）宫颈组织样本块。初始组织样本由妇科医生/外科医生送至医院，以确认疑似宫颈 dysplasia（CD）或宫颈癌（CC）的诊断。样本的登记数据包括患者年龄、转诊医生的疑似诊断以及医院基于分析确定的诊断。
纳入回顾性研究的样本标准为：（i）初步诊断为宫颈 dysplasia（CD），包括轻度、中度或重度 dysplasia，或宫颈鳞状细胞癌（CSCC）；（ii）经医院认证病理学家确认诊断，根据2016年生效的ICD-10-CM分配代码N87.0, N87.1, N87.2, C53, 和C53.9；（iii）FFPE块的大小允许至少连续切取25张4微米厚度的切片，且此后剩余至少50%的蜡块（用于应患者和/或其医生要求进行的 eventual 回顾性分析）。研究招募了所有符合上述标准的存档样本。非鳞状上皮相关的CC病例，如腺癌，被排除在外，因其属于具有不同形态学、病因学和分子驱动因素的异质性肿瘤组。
由于本研究是回顾性、非干预性的，不干扰常规诊断和治疗，不影响患者的任何医疗权利，且未给患者增加任何额外风险，因此未从个体处获取书面知情同意书用于本文所含任何数据的发布。
2.2 宫颈组织中的HR-HPV基因分型
将FFPE块切成5至11张4微米厚的切片，按照我们之前描述的方法处理以提取DNA。使用QIAamp DNA FFPE Advanced UNG试剂盒（Qiagen）按照制造商的建议进行DNA提取。通过测量A260 /A280 比值分光光度法评估DNA纯度。
使用分离的DNA，通过半定量Anyplex™ II HPV HR检测（记录病毒载量为低(+)、中(++)、高(+++)）（85/145个样本）或定量Allplex™ HPV HR Detection检测（记录病毒载量为Ct值）（60/145个样本）（均来自Seegene公司，韩国首尔）来检测14种HR-HPV基因型（HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 和68）。两种检测均包含基于人β-珠蛋白基因的内参（IC）。成功扩增IC证实了DNA质量良好。IC未能扩增的样本结果被丢弃。
为了将Allplex检测提供的Ct值转换为Anyplex产生的半定量HR-HPV量，我们使用含有HPV16 E6和E7基因全长拷贝的质粒pLJM1_pGK_E6E7 DNA构建了校准曲线。将质粒pLJM1_pGK_E6E7从106 拷贝到1拷贝进行10倍系列稀释。根据此校准，低值(+)对应于Ct值>40循环，中值(++)对应于Ct值在30–38循环范围内，高值(+++)对应于Ct值低于30循环。此校准数据与Oštrbenk Valenčak A等人2018年和2024年发表的数据一致。
2.3 数据统计分析
使用GraphPad Prism进行Fisher精确检验和非参数Spearman相关性的统计数据分析及图形表示，并使用JASP进行非参数Spearman相关性分析。
3 结果
3.1 研究人群
从医院样本库中检索到2016年至2024年间采集的对应于CSCC（79/145, 54.5%）和CD病例（66/145, 45.5%）的FFPE宫颈组织块。患者数据（诊断、疾病分级、采样年份）总结于表1。患者采样时的中位年龄为46岁（CD：35.5岁；CSCC：59岁）。CD患者在疾病分期分布相对均匀（CIN I：18/66, 27.3%；CIN II：20/66, 30.3%；CIN III：28/66, 42.4%），而大多数CSCC患者为癌症2级（58.2%, 46/79），1级占8.9%（7/79），3级占32.9%（26/79）病例。关于患者先前的治疗、筛查或HPV疫苗接种状态的信息不可用。在145名参与者中，只有两名在国家疫苗接种运动启动时属于有资格接种HPV疫苗的年龄类别；因此，大多数（98.6%）被视为未接种疫苗。
3.2 HR-HPV基因分型结果比较 - Anyplex™ vs Allplex™
在研究的第一年，HR-HPV基因分型使用AnyPlex检测完成，从2024年开始使用AllPlex检测，因为定量评估HR-HPV载量对于疾病结局的预后是可取的。之前对Allplex和Anyplex检测的直接比较发现HPV检测灵敏度无显著总体差异，研究表明具有高度一致性，且在基因型流行率或总体检出率方面无重大差异，预示着从半定量PCR向定量PCR的平稳过渡。一个薄弱点是必须将使用两种检测获得的结果合并进行全部分析。
使用检测试剂盒手册中提供的Ct截断值解释Allplex™检测的基因分型结果。据此，Ct值高于43的样本被解释为HPV阴性。使用HPV16 DNA构建的校准曲线初步将Allplex™结果转换为Anyplex™范围。在此初步转换中，Allplex™转换后的结果与AnyPlex™结果在50%病例中一致（9/18；表2）。在三个病例中，Allplex™检测到Anyplex™漏检的基因型，在一个病例中，Anyplex™检测到HPV33和HPV18，而Allplex™检测到HPV33和HPV16（表2，样本编号5、6、8和样本7）。值得注意的是，所有基因型差异均出现在低病毒载量的样本中。为了解决差异，最近发表的一篇文章描述了AllPlex制造商推荐的新的基因型特异性截断值：对于HPV16和18，Ct >40；对于HPV31、33、45、52和58，Ct>37；对于HPV35、39、51、56、59、66和68，Ct >35。这些截断值将基因分型差异减少到18个样本中的1个（5.5%），即样本编号7，AnyPlex报告为HPV18和HPV33，而AllPlex报告为HPV16和HPV33。关于病毒载量的差异仍然存在，AnyPlex™检测到的总体病毒载量低于AllPlex。这种AnyPlex™对病毒载量的“技术性”降低可能降低了病毒载量与疾病严重程度之间关联的显著性，但为了进行完整的数据分析，必须处理这一问题。
3.3 宫颈癌和 dysplasia 中的HR-HPV
3.3.1 宫颈组织中的多重HR-HPV基因型
在AnyPlex™和AllPlex™检测的合并分析中，145个宫颈组织中仅有6个为HR-HPV阴性（6/145, 4.1%）。所有CSCC样本，无论癌症分级如何，均至少对一种HR-HPV基因型呈阳性。所有六个HR-HPV阴性样本均来自CD组织（CIN I：4/6；CIN III：2/6）。
虽然大多数样本携带一种HR-HPV基因型（75/139, 53.9%），但近一半携带多种——47/139（33.8%）对两种HR-HPV基因型呈阳性，14/139（10.1%）对三种呈阳性，3/139（2.2%）对四种呈阳性（图1A）。大多数CSCC组织携带一种（37/79, 46.8%）或两种基因型（30/79, 37.9%），但携带最多HR-HPV基因型（四种）的样本 exclusively 来自CSCC组织（3/79, 3.8%）。在CD样本中，63.3%对一种HR-HPV基因型呈阳性（38/60），28.3%对两种呈阳性（17/60），仅8.3%（5/60）对三种呈阳性（图1B）。
值得注意的是，在CSCC和CD患者中检测到的HR-HPV基因型数量（一种 vs. 多种）存在统计学显著差异（p=0.0280）。癌变样本携带多种HR-HPV的可能性是2.19倍。当将CD和CSCC视为疾病的连续谱时，疾病严重程度（CIN I ➔➔ CIN II ➔➔ CIN III ➔➔ 1级 ➔➔ 2级 ➔➔ 3级）与检测到的HR-HPV数量呈正相关（p=0.015, r=0.202, Spearman检验）。
3.3.2 宫颈癌和 dysplasia 中HR-HPV基因型流行率
最常见的基因型是HPV16（127/139, 91.4%），其次是HPV33（32/139, 23.0%）、HPV39（13/139, 9.4%）和HPV18（11/139, 7.9%）。所有其他基因型在少于10个样本中被检测到（图1C）。三种HR-HPV基因型，HPV58、59和68，未被检测到。
HPV16和HPV33是两种最常检测到的基因型，与诊断无关。HPV16的流行率在CSCC中为93.6%（74/79），在CD病例中为88.3%（53/60）；HPV33的流行率在CSCC中为29.1%（23/79），在CD病例中为15%（9/60）。HPV16阳性样本的百分比随着CD和CSCC严重程度的增加而增加。在CD样本中，HPV16阳性样本的百分比从CIN I的67%（12/18）增加到CIN III的86%（24/28）；在CSCC中，从1级的71%（5/7）增加到3级的100%（26/26）。HPV45仅在CSCC中检测到，而HPV66和HPV31仅在CD病例中检测到（图1D）。
考虑到近一半样本携带多种HR-HPV基因型（64/139, 46.0%），我们分析了最常见的基因型组合。超过一半的HPV16阳性样本仅对HPV16呈阳性（68/127, 53.5%），而其他基因型主要在组合中检测到。HPV45、33、52、18或56的单一感染各发生在一个样本中，HPV35发生在两个样本中。总体上最常见的HR-HPV组合是HPV16+HPV33+（15/139, 10.8%），其次是HPV16+HPV18+（8/139, 5.8%）。CSCC病例也是如此。在CD中，第三常见的组合是HPV16+HPV31+（3/60, 5%）。
3.3.3 宫颈癌和 dysplasia 中的HR-HPV物种
进一步，我们决定研究一个更广泛的分类单位——HPV物种。本研究调查的14种HR-HPV基因型属于四个HPV物种——α5（HPV51）、α6（HPV66、56）、α7（HPV18、45、59、39、68）和α9（HPV16、31、35、33、58、52）。
大多数样本仅携带属于一个物种的HR-HPV基因型（100/139, 71.9%），其次是两个物种（35/139, 25.2%）和三个物种（4/139, 2.9%）。大多数仅对α9物种呈阳性（97/139, 69.8%），或为α9+α7组合（27/139, 19.4%）。其他物种组合存在于少于十个样本中。有趣的是，只有三个样本为α9物种阴性，其中两个对α7呈阳性，一个对α6呈阳性。
与每个样本的HR-HPV数量一样，CSCC组织更可能携带多种HPV物种（p=0.036）。此外，我们观察到同时存在属于α9和α7物种的基因型在CSCC组织中更常见，并且α9+α7阳性样本的数量随着疾病严重程度的增加而增加。总体而言，宫颈组织中检测到的物种数量与疾病严重程度相关（p = 0.0005; r = 0.285）。
3.3.4 宫颈癌和 dysplasia 中的HR-HPV相对载量
AnyPlex和AllPlex检测的联合使用允许基于AnyPlex使用的低-中-高方法半定量HR-HPV基因型的量。首先，我们查看了样本中的总体HR-HPV量。如果样本对多种基因型呈阳性，我们取检测到的HR-HPV的最高相对量。使用此方法，我们观察到与CD样本相比，更多的CSCC样本携带高HR-HPV载量——51/79（64.6%）vs. 27/60（45.0%）（p = 0.025）。此外，携带高HR-HPV载量的样本比例随着疾病严重程度的增加而增加。这在CD样本中尤为突出（CIN I：2/14, 14.3%；CIN II：8/20, 40%；CIN III：17/26, 65.4%），CIN III组织比CIN I更可能携带高HR-HPV载量（p=0.003）。
由于HPV16是最常见的（127/139, 91.4%），我们更仔细地检查了HPV16载量。更多的CSCC组织样本携带高HPV16载量，并且比CD样本显著更可能携带高HPV16载量（p=0.012）。此外，携带高HPV16载量的样本增加再次随着CD严重程度的增加非常显著——从CIN I的1/12（8.3%）到CIN II的3/17（17.6%），再到CIN III的15/24（62.5%），其中CIN III组织比CIN I更可能携带高载量（p=0.003）。
进一步，我们揭示了总体HR-HPV载量和HPV16载量与疾病严重程度显著相关（分别为p<0.001, r=0.288 和 p<0.001, r=0.354；Spearman检验）。此外，对于HPV39也观察到与疾病严重程度呈正相关（p<0.001, r=0.307），而对于HPV66和HPV31，相关性为负（分别为p=0.027, r=-0.184；和 p<0.001, r=-0.276）。
3.4 HR-HPV基因型流行率变化
获取可追溯至2016年的宫颈组织样本，使我们能够监测CSCC和CD中HR-HPV基因型流行率的变化。我们将样本分为三个时间段：2016-2018年（n=46, CSCC = 27/CD=19）、2019-2021年（n=54, CSCC = 26/CD=28）和2022-2024年（n=45, CSCC = 26/CD=19）（表1）。
总体而言，HPV16流行率在分析期间有所下降。2022年之前，HPV16在所有样本中的发现率为89.1%至92.6%（2016-2018年为89.1%，2019-2021年为92.6%）。在2022-2024年，HPV16的流行率下降至80.0%。在CSCC（2016-18：92.6%；2019-21：100%；2022-24：88.5%）和CD病例（2016-18：84.2%；2019-21：85.7%；2022-24：68.4%）中均观察到HPV16流行率下降。HPV18的流行率也观察到下降——从2016-2018年的17.4%下降到2022-2024年的2.2%。根据Fisher精确检验，2022年至2024年的样本比2016年至2018年的样本显著更不可能为HPV18阳性（p=0.032）（图2）。
HPV66、45、33、39和31的流行率总体上似乎有所增加。就HPV45而言，2016-2018年有2.2%的样本对HPV45呈阳性，而2022-2024年为13.3%。值得注意的是，HPV45仅在CSCC病例中检测到。对于HPV33，流行率从2016-2018年的13.0%增加到2022-2024年的31.1%。2022-2024年的样本比2016-2018年的样本成为HPV33阳性的可能性高三倍（Fisher精确检验，p = 0.045）。HPV39样本阳性率从2016-2018年的4.3%增加到2019-2021年和2022-2024年的11.1%。HPV31样本阳性率从2016-2018年的0%增加到2022-2024年的8.9%。就HPV66而言，流行率从2016-2018年的0%增加到2022-2024年的4.4%（图2）。值得注意的是，HPV31和HPV66均仅在CD病例中检测到。
4 讨论
HR-HPV流行率数据是一个重要的指标 ， 不 仅 提 供
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