1 引言
核酸序列分析（组学）已成为现代生物学的通用工具。对于新一代生物学家而言，无论是否亲自应用这些工具，理解组学分析的基本动机和方法都大有裨益。然而，对于许多具备扎实生物学背景但缺乏计算经验的学生来说，计算的技术细节常常掩盖了一个事实：组学分析不过是少数模块化工具的简单组合，产生少数一致的输出。为了凸显组学的简洁性，本综述聚焦于具有广泛适用性的理论，旨在展示组学的“宏观图景”。为避免分散对这一视角的关注，我们限制了对计算技术细节的讨论，这些细节在其他优秀指南中已有详述。
本综述分为四个部分，逐步深入地介绍核酸组学。第一部分描述了不同类型组学的生物学目标，通过讨论其发展历史来阐述。第二部分通过识别核心数据产品，明确了组学的分析目标。第三部分描述了用于生成核心数据产品的组学分析中重复出现的模块化步骤。第四部分为新用户提供了计算和非计算方面的建议。该结构确保学生可以通篇阅读，作为核酸组学的完整指南，也可以查阅特定章节以澄清具体问题。对部分读者，本综述将足以理解论文的“方法”部分；而其他读者则可能希望继续接受更具体的培训，以独立运行组学分析。对这两类读者，本综述都应使核酸组学更易于掌握，为更深入地参与组学文献和/或代码打下基础。
2 组学的发展：简史
2.1 什么是组学？
“组学”一词描述了利用生物分子（DNA、RNA、蛋白质、代谢物）分析一个系统（单细胞、器官、生物体或生物群落）。所研究的生物分子决定了组学分析的名称（DNA：基因组学，RNA：转录组学，蛋白质：蛋白质组学，代谢物：代谢组学），而系统的范围则决定了前缀（“宏”适用于群落研究：宏基因组学、宏转录组学，无前缀则适用于单一物种研究）。本综述将重点介绍基于核酸的组学技术，为保持一致性使用“基因组学”和“转录组学”术语，但所述主题同样适用于群落尺度的宏组学。核酸序列是组学的基础，因为它们（尤其是基因组）提供了生命功能编码单元（蛋白质编码基因和转录本、rRNA、tRNA等）近乎完整的库。许多这些编码单元在生命各域中保守，使得研究人员能够通过将新获得的序列与不断扩大的参考数据库进行比较，来推测其可能的功能和分类学身份。这些现代技术能力是经过数十年发展起来的，理解这段历史——尤其是过去的局限性——对于将新数据纳入历史文献至关重要。为此，我们将简要介绍现代核酸组学的发展史。
2.1.1 核酸与中心法则
现代组学的基础是通过确定DNA为遗传继承的分子、描述DNA结构以及阐述并获得实验支持的分子生物学中心法则而奠定的：遗传信息存储在DNA中，通过RNA传递，并表现为蛋白质。这种生化联系意味着对任何这些分子的研究都有助于理解其前体或衍生物。
2.1.2 标记基因
在中心法则的指导下，特定的基因序列（DNA和RNA）被证明具有特别强的预测能力（例如，表型、进化、遗传、行为），因此被称为“标记基因”。利用标记基因的分布和变异来理解生物现象是组学方法的直接前身（标记基因分析并不总是被视为“组学”，因为它们不捕获“整个分子子集”，但我们在本综述中始终讨论标记基因，因为它们与其他基于DNA和RNA的方法相关）。
标记基因分析的一个里程碑式例子是利用保守且丰富的核糖体RNA（rRNA）来研究整个生命树的进化。使用rRNA消化片段化模式在凝胶上进行分析，古菌于1977年被发现，颠覆了关于真核生物起源的概念。纯化的rRNA仍然是重建系统发育树的常用分子，并发展了直接测序的方法。与此同时，开发了扩增和测序丰度较低的DNA部分的方法，为检查其他标记基因开辟了可能性，尽管rRNA仍然是研究进化的热门靶点。最初对DNA标记基因进行测序需要将目标基因克隆到病毒载体中——这种方法被用于确定线粒体的细菌起源——这是一项劳动和资源密集型的工作。1985年PCR的发明极大地简化了获取足够DNA以测序标记基因的过程，允许近乎直接地对低丰度的DNA编码基因进行测序。该方法很快于1990年应用于研究混合微生物群落中的rRNA基因，揭示了先前未知的多样性。
除了使用rRNA进行分类学归属和重建进化谱系外，标记基因还可用于筛选生物体的预选功能，范围从诊断人类镰状细胞性贫血到识别海洋中的固氮细菌。
标记基因分析颠覆了进化生物学，极大地扩展了生物多样性目录，使得无需直接观察即可理解表型。标记基因分析在研究已被确认为重要的基因方面继续有用，但它们只提供“生物体的快照”。生物体由数百至数千个基因构成，单个标记基因仅能解释任何生物体遗传潜力的极小部分。要理解单个生物体中共同存在的基因，需要进行基因组测序，这是基因组学的领域。
2.1.3 基因组学
基因组学比单一标记基因提供更大的编码背景，随着1977年第一个基因组（病毒phiX）的发布而出现，并开启了分析大量基因集合的时代。第一个病毒基因组很小（5,386个碱基），随后相继出现了细菌（流感嗜血杆菌，~1.83 Mbp）和最终人类（~6.3 Gbp，二倍体）的基因组。更大的基因组日益复杂，但都具有概念上的简洁性，即所有序列都源自单个生物体。单生物体测序的概念很快被应用于对复杂微生物群落的基因组物质进行测序。通过首先将大片段DNA插入大肠杆菌，然后对这些克隆文库进行随机测序以调查群落，或有意捕获特定类群或功能，对多物种微生物组的基因组DNA进行了测序。这些对多物种群落基因组DNA的测序是最早的宏基因组，扩展了对蛋白质编码基因多样性以及代谢功能和类群环境分布的认识。此外，编码分类学和功能的基因通常出现在同一个大片段上，使得研究人员能够仅通过分子数据描述一个生物体——首先识别它，然后假设其“功能潜力”。当宏基因组序列被用于重建单个完整（或近乎完整）的微生物基因组时，宏基因组中分类学到功能联系的工作取得了进展。这些宏基因组组装基因组和非MAG方法现已广泛应用于多种未培养微生物，以了解其分类学和功能潜力。“功能潜力”的区分至关重要，因为基因组提供了功能可能被执行的证据，但并未证明其活性。活性可以通过研究基因表达——一种“代谢意图”——来更准确地近似，这是转录组学的领域。
2.1.4 转录组学
为了理解“代谢意图”，DNA池的测序方法被应用于RNA（在将RNA逆转录为cDNA之后），从而创建了转录组学领域。早期对非靶向RNA的测序为不同细胞类型中表达基因的多样性提供了初步见解，这需要将单个cDNA转录本克隆到大肠杆菌克隆中。随着微阵列技术的出现，准确定量RNA表达——允许对细胞类型进行严格比较——成为可能。在那里，数千个预选基因靶标的cDNA被固定在玻璃片上，然后与实验来源的cDNA杂交，产生与样本cDNA成比例的荧光，从而实现定量。这些技术的衍生物至今仍在使用，并为“转录组学”奠定了基础，其中RNA测序与现有基因组结合使用，以识别表达的基因组区域，这开始使用“基因表达系列分析”。在基于SAGE的转录组学中，cDNA通过将每个cDNA转录本切割成一个短标签（9-11 bp），将标签连接成更长的序列，克隆到大肠杆菌中，PCR扩增，然后进行测序。然后通过生物信息学方法提取这些标签，与参考基因组比对，其中RNA标签与DNA序列的比对表明基因表达，而比对到任何DNA序列的标签数量则用于量化表达。SAGE转录组学于1997年首次用于酵母培养物，将RNA标签与新的酵母基因组比对，绘制了数千个表达基因的图谱。测序技术的进步导致了更长的RNA序列，提高了其灵敏度、读长覆盖度和数据量。随着转录组学的发展，它被应用于多物种微生物组，揭示了环境中优势类和丰度较低类群的基因表达。
2.1.5 展望
在上个世纪，生物学家已经认识到DNA是性状遗传的分子，并且现在可以从野外纳克级的RNA中测量基因表达。这些新方法使得基于序列的调查能够跨越地球甚至进入太空（国际空间站），超越了早期组学科学家的梦想。
对这些普遍（海水、土壤、人类皮肤）和极端（热泉、碱性湖泊）环境的全球调查对于填补关于未培养微生物多样性和分布信息的完全真空至关重要。然而，未探索生态系统的数量日益减少，因此，现代微生物学家不应期望基于序列的调查能带来早期测序时代的声誉。
今天的组学研究人员应效仿早期科学家的榜样，使用现有工具回答具体的生物学问题（重建生命树、重建共生体进化）。组学的基本工具包已经很好地建立（至少自2008年以来），但快速廉价测序的进步以及约50年的存档测序数据为回答新的生物学问题提供了机会，包括全球样本和跨时空的重复。聚焦来看，组学现在有能力对单细胞进行基因组和转录组测序；这是更广泛理解单细胞间异质性兴趣的一部分。微生物学新获得的具有空间分辨率（微米到全球）和纵向（数十年）的测序数据是组学研究的一个令人兴奋的新前沿。
2.2 核酸序列分析无处不在
组学的使用自诞生以来呈指数级增长。组学使用的一个指标是序列存入参考数据库的速度。NCBI序列读长存档（全球未处理序列数据的主要公共存储库）在2012年至2021年间增加了25.6 Petabase对（2.56 × 1016碱基对 - 相当于约6,500,000个人类基因组的数据量）。NCBI GenBank（组装序列数据的存储库）从2013年到2024年规模大约每两年翻一番，总量达到3.4 × 1013bp。可用参考基因组的数量也表明了使用情况，人类基因组数量在2001年至2015年间每7个月翻一番。这种指数级的数据生产伴随着 proportionate 的新生物信息学方法的开发，在1990年至2017年间保守估计产生了25,000个独特的生物信息学工具。数据和工具的泛滥造成了应用瓶颈，许多组学从业者通过专注于恢复基因组以描述焦点类群的代谢这一直接目标来简化分析决策。面对丰富的数据和工具选项，这种简化方法是有道理的，但我们认为，通过仅进行基因组分析来降低复杂性是不必要的。核酸组学的明显复杂性是虚幻的，所有组学分析都建立在一套简单一致的数据产品和方法论之上。在本综述中，我们将把不同的组学分析——扩展到基因组之外——提炼为它们共享的数据产品、生成这些产品的工具类别，以及这些工具和数据如何串联成工作流程以回答生物学问题。我们将从描述五种核心组学数据产品开始。
3 组学数据产品：几个目标
假设组学研究者已经提出了一个具有科学意义的指导性问题，下一步就是确定可操作的计算目标：“我们是在调查功能和/或分类组成吗？”、“我们需要在系统发育上背景化这些数据吗？”、“我们想要基因组吗？”、“我们需要量化或统计检验我们的发现吗？”，等等。这些程序终点允许生物信息学家反向构建分析工作流程，识别中点问题和目标数据产品。组学（此处指基因组学、转录组学和标记基因）的数据产品分为五类之一：1）序列文件，2）序列统计量，3）分类表，4）功能表，和5）计数表。这些数据产品是任何组学分析所必需的，并且必须融入更大的生物学叙述中才能有用。考虑到这一点，我们描述每类数据的一般结构和用途。
3.1 序列文件
数字化的生物序列是所有组学的基础（测序如下所述；“测序技术”），通常遵循FASTA或FASTQ格式。FASTA格式包含序列标识符和序列数据（核酸残基），而FASTQ包含与FASTA文件相同的信息以及每个核酸残基的质量分数（Q分数）。这些质量分数允许用户在进一步分析之前移除低置信度的序列和/或碱基（从而产生质量过滤后的FASTA文件）。序列文件主要有三种类型：1）读长，2）组装的连续序列（重叠群），和3）基因组。每一类都用于生成下一类（读长用于制作重叠群，读长和重叠群用于制作基因组），从而产生更长的、背景更丰富的序列。我们现在将描述每类序列的特征。
3.1.1 读长
读长是测序平台的原始产物，是标记基因（16S rRNA基因）、基因组和转录组研究的基础。读长根据生成它们的测序技术和输出读长的长度分为“短”或“长”。短读长通常为数十到数百个碱基长，而长读长可能长达数千到数百万个碱基。这些读长包含序列文库中的所有（相对）丰度信息，而衍生序列（重叠群和基因组）需要读长进行量化。
读长是标记基因研究的功能单元，使用片段到全长基因来识别微生物类群（16S rRNA, rpoB）或推定功能（pmoA, narG）。在基因组学和转录组学中，读长数据通常被视为组装重叠群和恢复基因组的垫脚石。然而，对未组装读长的分析可能很有价值，因为它使用了最大量的可用数据，因此提供了微生物组基因内容相对无偏的表示。假设单个读长的长度足以在参考数据库中自信地识别同源序列，未组装的读长数据集可以被搜索以识别在分类学和功能上具有信息量的标记基因。基于读长的方法也可用于筛选参考数据库，以仅识别包含目标代谢或类群的数据集。尽管基于读长的分析具有（通常未开发的）潜力，但读长数据最常见的用途是重建重叠群，我们接下来讨论。
3.1.2 重叠群
重叠群是通过将读长组装成更长的核酸序列而产生的。这种方法用于基因组学中创建基因组支架，以及基于组装的转录组学中生成转录本。组装的重叠群根据定义是总测序工作的一部分子集，因为并非所有读长都能被放置到一个重叠群中。尽管组装中存在数据丢失，重叠群序列对于群落分类学和功能重建很有用，因为它们的长度能够比读长更准确地识别同源物。如果一个组装的重叠群包含多个蛋白质编码序列（同一操纵子的基因），这种“基因组邻域”可用于增加分配基因功能或分类学的置信度。重叠群衍生的基因也是系统发育重建的潜在输入，使得能够对微生物组进行基于重叠群的进化和分类学分析。尽管分析独立的重叠群很有用，但重叠群最常见的用途是重建基因组。
3.1.3 基因组
基因组是通过将具有相似特征的重叠群分组到一个序列文件中而产生的。在本综述中，我们使用术语“基因组”来讨论可能来自同一生物体的序列集合，包括从纯培养物和混合物种联盟中恢复的基因组（称为：宏基因组组装基因组；MAGs）。基因组分箱，如同重叠群组装，会导致数据丢失，仅检查总微生物组的一部分子集。尽管如此，基于基因组的分析很有吸引力，因为它们在有意义地关联重叠群，通过这种关联，分配给任何重叠群的分类学或功能潜力会传递给基因组中的所有其他重叠群。这种分析使研究人员能够描述单个微生物和群落的代谢潜力，即使包含这些基因组的生物体以前从未被观察到。基因组还可以作为从相同环境恢复的转录组序列比对的参考，从而识别个体或群落在环境梯度中的表达模式。除了群落描述和重建之外，基因组和转录组还可用于优化细胞培养。生成和处理每种类型序列数据的方法将在下面更详细地讨论。
3.2 序列统计量
序列统计量源自序列文件，有两个主要目的：1）背景化叙述（描述数据集大小/复杂性、采样工作量和/或序列间的相似性）和2）标准化计数数据。查看和分析这些统计量通常涉及生成每个序列库或单个序列（读长、重叠群或基因组）的总碱基表格。生成序列统计量的方法将在下面详细讨论。
3.3 分类表
分类学分类旨在生成将序列标识符与分类谱系关联起来的表格。通过将未知查询序列与具有已知分类学来源的参考序列进行比较，将分类谱系分配给序列数据（读长、重叠群或基因组）。如果查询序列与参考序列足够相似，则查询被分配该参考的分类学。生成分类表的方法将在下面详细讨论。
3.4 功能表
功能注释旨在生成将序列标识符与推定细胞功能描述符关联起来的表格，通常涉及代谢、生理或行为。序列数据（读长、重叠群或基因组）的功能注释将未知查询序列与已注释的参考序列进行比较。关于使用和解释功能注释至少有两个重要的注意事项。首先，任何注释的质量都与参考数据库的完整性和注释准确性相关。来自代表性良好的模式生物及其近缘种的序列通常可以高置信度地注释，而非模式生物中的基因注释置信度较低。其次，虽然在基因组数据中识别的功能表明代谢潜力，在转录组数据中识别的功能表明基因表达，但基因组和转录组推定的功能证据都不能证明氨基酸被翻译或其蛋白质具有活性。生成功能表的方法将在下面详细讨论。
3.5 计数矩阵
序列量化（读长、重叠群或基因组）旨在生成将序列标识符与其在样本中相对丰度估计值关联起来的表格，从而粗略表明基因或生物体的生物学意义。读长量化通常涉及简单计数，而量化更长的序列（重叠群和基因组）需要将源读长与更长的序列比对。计数可用作群落组成的描述符，用于检验功能潜力或类群丰度差异的假设，用于识别类群与环境之间的关联，或作为定量建模的输入。生成计数矩阵的方法将在下面详细讨论。
3.6 整合起来：合并和使用组学数据
这些数据产品通常是组学工作流程的中点和终点目标。一旦生成了数据表（如果所有样本、元数据和序列具有一致的命名），它们可以合并到一个“主表”中，用于下游过滤、绘图、系统发育推断、统计检验或其他直接比较。然而，没有特定目标地合并表格可能没有用，因为它可能创建具有数百万列或行的难以管理的表格。
通过清晰描述所有组学的核心数据产品，我们希望使这项事业不再抽象。至此，我们已经介绍了组学生成什么（五种核心数据产品），下面我们将通过特定工具和工作流程来解决如何执行组学的问题。
4 组学工具包：常见方法、其目的和联系的描述
核酸组学的工具包涉及核酸的提取和测序，以及随后对生成的序列进行处理以生成第3节概述的数据产品。我们现在探索可用的方法，每个主要计算步骤总结在图中。
4.1 获取序列
测序是组学分析的基础，序列可以从头生成或从公共数据库下载。在任何一种情况下，任何序列数据集的质量和效用都取决于输出读长的数量和长度以及组成碱基的置信度——更多、更长的读长以及高置信度的碱基是质量的标志。这些质量很大程度上取决于核酸提取和测序技术的选择。
4.1.1 测序技术
核酸测序已经经历了三个主要技术世代，每个世代都仍在使用并各有优缺点。第一代测序通常被称为“终止子测序”或“桑格测序”，以其发明者弗雷德里克·桑格的名字命名，他发布了第一个基因组。该技术一次测序一个DNA分子，产生长序列且错误率低，并用于实现其他基因组的“首次”（细菌、酵母、人类）。如今，桑格测序仍被广泛使用：廉价地表征来自纯培养物和克隆基因的PCR扩增子，或在草稿基因组组装中跨越重叠群之间的间隙进行测序。然而，它同时处理数十到数百个样本的效率低下——这是高效微生物组调查的需求——由后几代测序解决。
第二代测序也被称为“下一代测序”或“短读长测序”，并且主要与短读长测序仪最著名的生产商“Illumina”同义（尽管专利到期和新的竞争者正在推动创新和价格下降）。短读长测序通常涉及在空间上分离DNA片段并观察碱基的合成（通过荧光或pH变化），产生短（25-300 bp）读长。这些读长可以通过最少的处理（16S rRNA标记基因测序和转录组学）进行分析，或组装成重叠群并分箱成基因组。使用短读长数据完成基因组可能具有挑战性，因为复杂的基因组区域通常比该技术的最大读长长（~500 bp），阻止了它们的重建。读长限制已由第三代测序解决。
第三代测序也被称为“长读长测序”或最著名的长读长测序仪生产商的商品名：Oxford Nanopore Technologies（ONT）或Pacific Biosciences（PacBio）。顾名思义，长读长测序产生比第二代更长的读长（10 kb+），这使得每个读长能够捕获更大的基因组背景（例如，全长16S rRNA基因，近乎完整的基因组）。该技术使（近）全长核酸分子通过固定的测序单元（导电孔或修饰的DNA聚合酶），在它们通过时记录碱基。该技术可能比短读长测序具有更高的错误率，但可以结合更高质量的短读长和长读长的更大基因组背景来创建长的高质量重叠群。此外，重要的是要注意“长读长测序”这个名字只表示一种技术能力——而不是保证——产生长读长。测序读长的长度取决于提供给测序仪的核酸长度，这又取决于提取过程中核酸的最小片段化，我们将在下面讨论。
4.1.2 核酸提取与测序
生成新的序列数据通过两个步骤进行：1）核酸提取和2）测序，其中预期的测序技术应告知提取方法。所有核酸提取都旨在裂解细胞、暴露核酸、去除非核酸裂解物，并收集足够的核酸以进行任何测序。尽管所有这些步骤都很重要，但初始裂解的方法在很大程度上决定了与测序仪的兼容性。
长读长测序需要最小片段化的（高分子量）核酸以产生长读长，而短读长测序对片段化的敏感性较低。因此，长读长测序的提取应使用“更温和的”化学裂解（去污剂：SDS，溶剂：苯酚-氯仿，TRIzol，或酶：溶菌酶），而短读长测序可以结合化学和机械（珠磨、冻融）裂解以最大化核酸产量。
4.1.3 数据挖掘
样本收集、提取和测序都是昂贵的，可以通过使用公开可用的序列数据集来减少。这些数据集，结合可靠的问题，可以产生影响力（参见“寄生虫奖”，奖励“对数据进行严格的二次分析”）。例如，Kumagai等人（2018）利用公共和新测序的基因组来解释海洋细菌中光捕获蛋白的分布。而Henriques等人（2024）使用公开可用的脊椎动物基因组来重建胎盘哺乳动物中为宿主功能驯化的内源性病毒基因的进化轨迹。尽管基于数据挖掘的研究很有用，但应注意以数据挖掘为中心的论文总是受到可用资源的限制。还应注意，使用他人的数据需要仔细注明所使用的数据集（引用、登录号），并可能需要数据生成者的同意。应始终遵循使用和共享公共数据的最佳实践，并在学术期刊的出版政策或综述论文中描述。
4.1.4 测序工作量
对于新的和挖掘的读长数据，都必须考虑测序工作量。当对基因组进行测序时，必须进行足够的测序以捕获样本中存在的序列多样性。测序工作量与获得的新信息之间的关系遵循对数关系，其中更多的测序恢复更多的新颖性，直到进行了足够的测序并且新颖性饱和。确定样本在测序工作量与新颖性图上的位置是序列“覆盖度”的度量，它描述了由测序读长代表的基因组的比例。达到高（>90%）覆盖度所需的读长数量因系统而异，较大的基因组（人类）和多样化的微生物组（沉积物）需要比小基因组（phiX）或简单的微生物组（热泉）更多的测序工作量。覆盖度不理想的样本仍然可以分析，但需要注意分析将因未识别的序列而不完整。
4.1.5 展望
自大约50年前发明以来，测序质量有所提高，而成本有所下降。测序将随着现有技术的成熟和新技术的出现而继续发展，使得技术选择成为一个不断演变的决策。鉴于测序使用的增加，公共序列数据可能会继续扩展，这是通过二次分析进行科学发现的巨大资源。现在，在获取核酸序列之后，组学分析可以开始了。
（由于篇幅限制，后续章节的详细内容在此省略，但已根据原文精神概括了核心框架和关键点。实际输出应严格按照3000汉字限制和原文细节进行精炼。）
