TooSendanin导致TRPV4过度激活，从而引发细胞内钙离子过量积累，并对结肠产生毒性作用

马兜铃酸苷（TSN）通过激活肠道TRPV4通道引发钙离子内流和屏障损伤，证实炒制工艺可降低TSN含量及毒性。

戴慧|刘桥|张新梅|张景成|尹方洲|尹武

南京大学生命科学学院（仙林校区），南京大学药学生物技术国家重点实验室（SKLPB），中国南京210046

摘要

民族药理学意义

川楝果（FMT）是一种在多种传统医疗体系中广泛使用的天然药物，具有悠久的应用历史。然而，过量使用FMT可能导致严重的肠道毒性。导致这种毒性的具体成分及其潜在机制尚不清楚。

材料与方法

通过超高性能液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）分析了FMT和炒制川楝果（SFFMT）之间的成分差异。随后，利用生物信息学分析、分子对接、动力学建模和微尺度热泳（MST）技术确定川楝素（TSN）作用于肠道瞬时受体电位香草酸受体4（TRPV4）。通过钙离子（Ca²⁺）荧光探针、流式细胞术、免疫荧光分析和Western blotting检测了TSN引起的钙离子升高，进而发现这会导致肠道屏障损伤。最后，通过H&E染色、小鼠内镜检查和免疫荧光分析证实了过量口服TSN会导致小鼠肠道屏障损伤。

结果

首先，SFFMT中的TSN含量显著低于FMT。其次，研究表明TSN能够激活TRPV4，过量摄入TSN会导致结肠上皮细胞中的钙离子（Ca²⁺）水平升高和过载，从而引发急性结肠毒性。小鼠模型实验也证实了高剂量TSN会导致结肠屏障损伤。

结论

过量TSN会异常激活TRPV4，导致细胞内钙离子水平升高。这一现象被认为是FMT相关结肠毒性的主要原因。

引言

川楝果（FMT）是Melia toosendan Sieb. et Zucc（He et al., 2011）的干燥成熟果实，冬季采收后去除杂质并晾干。作为一种传统中药，FMT具有悠久的临床应用历史，常用于益气、止痛、驱虫、治疗癣症以及促进肝胃健康（Xie et al., 2008）。然而，FMT的毒性限制了其在临床中的应用。许多古代医学典籍，如《名医别录》（梁朝，公元前502-557年）、《本草纲目》（元朝，公元前1271-1368年）和《本草精华》（清朝，公元前1644-1912年）都记载了FMT的毒性（Chang et al., 2023）。研究表明FMT具有肝毒性（Liu et al., 2016）、肾毒性和胃肠道毒性（Wei et al., 2022）。然而，将FMT切成厚片并炒至表面呈焦黄色制成的SFFMT可以减少这些毒性反应（Chen et al., 2018）。最新研究指出，TSN是FMT中的主要毒性成分，能够阻断神经肌肉传导，导致呼吸中枢抑制（Wei et al., 2019）。此外，过量摄入TSN会导致严重恶心、呕吐、腹痛和腹泻。与传统中医医院的医生访谈显示，FMT在临床应用中最常见的急性不良反应是急性胃肠炎。在常规剂量下，偶尔会出现胃肠道不适。值得注意的是，SFFMT显著降低了其对胃肠道的毒性作用。

TSN是FMT的主要活性成分和毒性成分（He et al., 2010）。从临床角度来看，过量TSN是引起胃肠道反应的主要毒性成分。这些反应会损害胃肠道黏膜，导致局部充血、水肿和炎症反应（Li et al., 2020; Zhang et al., 2022）。一些研究表明，TSN会导致细胞内钙离子（Ca²⁺）浓度异常升高，这一过程可能是TSN引起黏膜损伤的原因（Li et al., 2004）。文献研究显示，钙离子调节蛋白TRPV4在调节肠道上皮细胞屏障中起重要作用（Emilie et al., 2011）。TRPV4（瞬时受体电位香草酸受体4）属于TRP离子通道家族，参与多种生理病理过程（Huang et al., 2020）。TRPV4在肝脏、皮肤和肠道等器官中高表达（Nathalie, 2014）。研究发现，IBD患者的TRPV4表达显著增强（Kenjiro et al., 2018）。TRPV4的异常高表达和激活会导致细胞内钙离子过载（Niu et al., 2024），进而引发细胞凋亡和炎症通路激活（Zhao et al., 2021）。TRPV4分布于结肠上皮的紧密连接区，直接调节黏膜屏障功能。TRPV4的激活会导致结肠上皮紧密连接蛋白异常磷酸化，破坏紧密连接结构并增加细胞间通透性（Huang et al., 2020）。

由于目前关于FMT及其成分TSN引起的肠道毒性的研究不足，本研究旨在通过体外和体内药理学研究、分子动力学模拟以及UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术阐明TSN引起的急性肠道毒性的浓度范围、靶点和潜在机制。同时，研究还旨在证明加工后的FMT可以减少其毒性成分，从而提高其临床应用的安全性。

材料

Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和fluo-4 Ca²⁺测试试剂盒购自Yeasen生物技术公司（上海，中国）。MTT细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒购自Beyotime生物技术研究所（武汉，中国）。乙腈（LC-MS级）和甲醇（LC-MS级）购自Merck公司（德国达姆施塔特）。

本研究使用的抗体如下：GAPDH（Cat# BS65483M），购自Biogot技术公司（南京，中国）；E-钙粘蛋白（Cat#

炒制后FMT中川楝素（TSN）成分的变化

通常会对FMT进行炒制处理以减少其胃肠道、肝脏和神经毒性。FMT和SFFMT的活性成分通过水回流提取和超声甲醇提取法提取，然后干燥得到提取物。水回流法提取FMT和SFFMT的产率分别为28.9%和21.6%，而超声乙醇法提取的产率分别为18.15%和13.9%。使用FMT和SFFMT进行了MTT实验

结论

川楝素（TSN）是川楝果（FMT）的主要生物活性成分，在安全剂量范围内具有显著的抗炎、抗肿瘤和杀虫作用（Yang et al., 2023）。FMT的药理作用主要归因于TSN。然而，过量摄入FMT或TSN都会导致明显的毒性。在我们的研究中，观察到在100至200 nM浓度范围内，TSN会导致结肠上皮损伤

CRediT作者贡献声明

张新梅：资源获取、研究调查、资金筹措。刘桥：数据分析、数据管理。戴慧：写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、软件使用、项目管理、研究调查、数据管理。尹武：写作——审稿与编辑、初稿撰写。尹方洲：写作——审稿与编辑、初稿撰写、结果验证、资金筹措。张景成：研究调查、数据分析、概念构思

未引用参考文献

Chen, 2018; Emilie et al., 2011; Yue et al., 2024.

利益冲突声明

所有作者声明没有利益冲突。

数据可用性

数据可应要求提供。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号81873002和82373902）和江苏省重点发展项目（BE2023806）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。