引言
J-聚集体是染料分子（如花菁、卟啉或特殊取代的BODIPY）通过滑移堆叠形成的有序超分子组装体。这种排列方式导致过渡偶极间产生协同电子相互作用，从而产生窄而显著红移的吸收带（J带）、高摩尔消光系数、小斯托克斯位移和增强的荧光量子产率。凭借这些独特的光学性质，J-聚集体在生物成像、光子学、纳米医学等领域有广泛应用。它们能增强荧光和光声成像中的组织穿透和信号对比度，其高效的非辐射衰变路径可实现有效的光热治疗。在分子激子学中，J-聚集体是能量转移和人工光捕获的模型系统。此外，与等离激元纳米结构的集成促进了强激子-等离激元耦合，从而推动了纳米光子和光电子应用。特别是具有强J-聚集倾向的J-聚集体极具价值，因为它们能自发、稳定地形成有序超分子结构，展现出显著的光学性质。其稳定的聚集增强了光稳定性和重现性，这对生物医学和传感应用至关重要。然而，设计能在水性生理环境中快速稳定聚集且不损失性能的小有机染料仍是一个重大挑战。先前研究表明，形成良好组织的J-聚集体需要精细调控染料的疏水性、分子间相互作用和堆积几何。
目前，大多数基于J-聚集体的传感和成像探针功能如同“常亮”系统，缺乏选择性报告特定生物变化的能力。相反，可激活（如“开启”）探针在受到特定刺激（如pH变化、酶切、氧化还原变化、金属离子、ROS）触发前保持暗态。这些探针显著提高了生物成像中的信背比，产生更清晰、更精确的读数。然而，很少有研究利用激活后自组装（如J-聚集）来放大荧光信号。最近，Li等人构建了基于喹唑啉酮衍生物的可激活J-聚集体，通过响应体内ONOO–随后原位自组装成J-聚集体，产生红移的强荧光信号。理想的基于J-聚集的可激活探针在遇到目标分析物前应保持非聚集和非荧光状态，分析物触发发射性J-聚集体的形成，从而实现信号自放大。
活性氧（ROS）如羟基自由基（•OH）、过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2•–）和过氧亚硝酸盐（ONOO–）在生理和病理中扮演双重角色。虽然在细胞信号传导中必不可少，但过量的ROS会导致氧化应激，损伤蛋白质、脂质和DNA，从而引发炎症性疾病、癌症、神经退行性变和缺血再灌注损伤。由于ROS的瞬时性和低丰度，在体精确绘制其时空动态仍然具有挑战性。
花菁染料通常是两个杂环通过聚次甲基链连接的共轭分子，而氢化花菁是花菁染料的还原衍生物，氧化后恢复荧光。这种可逆的氧化还原行为使其作为可激活荧光探针非常有用，特别是在生物系统中检测ROS。在氢化花菁中，聚次甲基链被氢化，破坏了扩展的π共轭，从而猝灭荧光。遇到羟基自由基、超氧阴离子或过氧亚硝酸盐等氧化性物质时，共轭恢复，荧光“开启”，实现氧化应激的实时监测。其高灵敏度和选择性使其成为研究多种病理条件下（包括神经退行性疾病、炎症和癌症）ROS动态的有价值工具。然而，考虑到许多花菁染料在水性介质中会发生随机聚集并导致荧光猝灭，使用具有J-聚集倾向的花菁作为氢化花菁的母体染料可能更具优势。
发射波长在第二近红外窗口（1000–1700 nm，NIR-II）的荧光团的发展显著推动了深层组织光学成像领域，因为该光谱范围内的组织自发荧光被抑制、光子散射减少、穿透深度增强。各种小分子、聚合物和纳米材料基荧光团被开发以满足NIR-II成像的需求，为疾病诊断、影像引导治疗和实时监测提供了新的可能性。当与可激活探针结合时，NIR-II成像能够对氧化微环境（如发炎的肺部或再灌注的肝组织）中的热点进行高对比度可视化。在NIR-II光谱窗口，J-聚集体不仅提供其独特的光学性质，还能在激活后作为原位形成的纳米级发射体，在病变部位停留更长时间——这对于在体成像和特定部位的诊疗一体化至关重要。
在此背景下，研究人员开发了一种J-聚集驱动的、可激活的NIR-II传感器，用于检测活性氧，特别是羟基自由基。该传感器通过设计一种具有强水性J-聚集倾向的七甲川花菁染料，然后将其还原为氢化花菁（无发射且不能聚集）而制成。羟基自由基介导的氧化将氢化花菁转化回母体七甲川花菁，后者在水性介质中迅速自组装成高度稳定且强发射的J-聚集体。该机制提供了纳摩尔级灵敏度和特异性ROS检测。研究人员通过在小鼠肺炎和肝缺血再灌注损伤模型中的在体成像验证了该系统，其中升高的ROS水平驱动了局部荧光激活。该设计提供了一种荧光开启型ROS传感器，具有J-聚集体在NIR-II区域的高亮度和锐利光谱特征，适用于高对比度、深层组织成像。该策略可通过探索具有J-聚集倾向的合适响应性染料，扩展到其他触发因素（如酶、pH和活性氮物种RNS）。
实验部分
光学光谱测量
羟基自由基通过将过氧化氢与Fe2+（Fe2+/H2O2= 1/6，摩尔比）原位反应产生。将FeSO4•7H2O溶液（2 mM）和H2O2溶液（12 mM）混合，在pH 4.0 HEPES缓冲液中生成6 μM •OH，将不同量的•OH溶液快速加入HEPES（10 mM, pH 4.0）中的Hydro-J1050溶液，探针终浓度为5 μM。NIR-II吸收和发射光谱在25 °C下测量。
动物实验
所有程序均经华南农业大学实验动物中心伦理委员会审查批准，并完全遵守中国国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》和《实验动物福利指南》。
对乙酰氨基酚诱导的肝损伤实验
小鼠（每组n = 3）禁食过夜，然后通过腹腔注射APAP（300 mg·kg–1）处理。处理小鼠6小时后，使用含2%异氟烷的氧气麻醉小鼠，然后静脉注射3.5 mg·kg–1Hydro-J1050或IR783进行在体荧光成像。
肝缺血再灌注损伤在体成像
在雄性BALB/C小鼠（7-8周龄）中建立肝缺血再灌注损伤模型。小鼠随机分为四组（n = 3）：
- •
对照组：未手术的健康小鼠。
- •
I/R 30 min/24 h组：经历30分钟肝缺血和24小时再灌注。
- •
I/R 60 min/24 h组：经历60分钟肝缺血和24小时再灌注。
- •
NAC治疗组：在60 min/24 h I/R方案前，预先用N-乙酰半胱氨酸（NAC；150 mg·kg–1，每天，持续2天）处理。
手术在吸入1%异氟烷诱导的麻醉下进行。中线开腹后，用无创伤血管夹夹闭肝动脉和门静脉诱导缺血。在指定的缺血期后，移除夹子以允许再灌注，并分层关闭腹腔（总再灌注时间：24小时）。注射Hydro-J1050（3.5 mg·kg–1，静脉注射）后，在2%异氟烷麻醉下对小鼠进行成像。
LPS诱导的急性肺损伤模型
禁食过夜后，小鼠（每组n = 3）接受气管内滴注脂多糖（LPS），剂量为5或10 mg·kg–1。对照组接受气管内滴注生理盐水。处理6小时后，所有小鼠用含2%异氟烷的氧气麻醉，随后气管内滴注Hydro-J1050（3.5 mg·kg–1）以进行在体荧光成像。
结果与讨论
J-聚集七甲川花菁染料及ROS响应探针的设计与合成
为建立一种能在生物环境中形成J-聚集体的可激活探针，研究人员设计并合成了一种新型七甲川花菁染料（Et-J1050），其以两个苯并[g]吲哚作为末端基团。与更常用的异构体苯并[b]吲哚不同，苯并[g]吲哚部分表现出不同的共轭排列和改变的电子状态。在介观位置引入了庞大且支链化的N-苄基三氟乙酰胺取代基作为分子间隔基。这种空间位阻抑制了不希望的H-聚集（面对面π-π堆积），同时促进了有利于J-聚集在水性环境中稳定的滑移分子排列。类似的“空间间隔基”策略已被报道用于调节花菁的自组装，其中疏水相互作用和空间位阻的平衡决定了聚集形态和光学响应。母体染料Et-J1050随后被NaBH4还原得到其氢化花菁形式（Hydro-J1050）。还原使聚次甲基链中的一个双键饱和，破坏了π共轭，并显著猝灭荧光。花菁染料的这种可逆氧化还原转化先前已有报道，并成为设计响应ROS的可激活探针的基础。重要的是，Hydro-J1050在生理条件下以非聚集、非荧光状态存在，但可被活性氧重新氧化再生为Et-J1050，后者随后在水性介质中迅速发生J-聚集。最终产物和中间体已通过1H/13C NMR和高分辨质谱得到充分表征。
光学性质与J-聚集行为
首先评估了Et-J1050在一些常见有机溶剂中的固有光谱性质，该染料在约890 nm和930 nm处分别表现出单体吸收和发射最大值，与典型的七甲川花菁一致。将其DMSO溶液滴定到水性缓冲液（pH 7.4 HEPES）中时，出现了一个以~1050 nm为中心的新的尖锐吸收带，同时890 nm处的单体吸收带消失，溶液颜色从绿色变为橙红色。观察到的J-聚集体形成前后吸光度的显著变化源于聚集态染料分子之间的强激子耦合。自组装时，染料采用有序的头对尾排列，导致离域激发态和特征性红移J带的形成。该过程将振荡器强度从单体吸收带重新分配到聚集带，导致单体吸收显著降低和强烈、光谱狭窄的J-聚集体吸收峰的出现。当水含量达到99.5 v/v %时，单体吸收带几乎消失，1050 nm处的新吸收带变得突出。在HEPES缓冲液中，吸收峰和相应的发射峰显著重叠，产生窄的斯托克斯位移，再次符合经典J-聚集体的特征。形成的J-聚集体颗粒可以通过离心纯化，然后重新分散到pH 7.4 HEPES缓冲溶液中，这表明J-聚集体具有高稳定性。DLS测量表明，Et-J1050在pH 7.4 HEPES缓冲液中组装成平均流体动力学直径约为30 nm的纳米级聚集体。互补的TEM分析揭示了球状J-聚集体的形态，进一步证实了染料在水性介质中聚集体的形成。
评估了J-聚集体在HEPES缓冲液和模拟生物流体（添加了10%血清的DMEM）中形成的时间依赖性。将Et-J1050的DMSO溶液滴定到HEPES缓冲液中后，J-聚集体的吸收带几乎立即（约1分钟）出现，表明在水性介质中J-聚集体形成迅速。类似地，在添加血清的DMEM中J-聚集体的形成也很快，但其吸收带略宽。Et-J1050在pH 7.4 HEPES缓冲溶液中的临界聚集浓度测定为73 nM，伸长关联常数Ke估计为1.4 × 107M–1。这验证了该染料在水性介质中强烈的J-聚集倾向，这有利于J-聚集诱导的“开启”式生物传感和生物成像。此外，J-聚集体经离心沉降后仍能容易地分散在水性介质中。重新分散的J-聚集体在重新分散后立即显示出平均流体动力学直径约为50 nm，并在60分钟内逐渐减小至约40 nm。评估了J-聚集体在生物流体（含1% HEPES的FBS中）中的长期（长达72小时）光谱稳定性。与FBS孵育72小时后，J-聚集体的最大吸光度降至其原始值的72%，表明J-聚集体在生物流体中相对稳定。
将Et-J1050还原为Hydro-J1050导致890 nm处的吸收带完全消失，并在400至500 nm之间出现一个新的宽吸收带，溶液颜色从绿色变为黄色。这个新的吸收带对应于还原后聚次甲基链被氢化的Hydro-J1050。该反应破坏了花菁骨架中的扩展π共轭，导致吸收带蓝移。正如预期，Hydro-J1050在NIR-II区域基本上无荧光，这有利于最小化背景信号。暴露于羟基自由基后，Hydro-J1050被迅速氧化回母体花菁，恢复了1050 nm处的J带吸收和相应的NIR-II荧光发射。荧光信号在ROS浓度范围内呈线性增加，检测限为3.3 nM。这种“开启”行为提供了高对比度，并消除了基于强度的猝灭传感器的模糊性。显然，Hydro-J1050可以作为检测•OH的NIR-II荧光传感器。通过将染料暴露于激光辐射不同时间进行的光稳定性实验表明，Et-J1050 J-聚集体在激光照射下表现出更高的稳定性。
接下来评估了Hydro-J1050的检测选择性和抗干扰性。Hydro-J1050对检测•OH表现出很强的抗干扰能力和选择性，优于多种潜在干扰物，包括离子、生物硫醇、氨基酸、硫化物和一些ROS。评估了pH对荧光发射的影响。尽管暴露于•OH后1050 nm处的荧光强度随pH升高而降低，但在生物pH范围内其变化相对较小，表明该探针适用于生物应用。
ROS相关疾病的NIR-II荧光在体成像
在成像前评估了传感器的生物安全性。通过MTT实验和H&E染色分析对探针进行细胞毒性研究。L929细胞在与探针Hydro-J1050孵育后显示出高存活率，各组组织未见明显组织病理学异常。此外，静脉注射到小鼠体内后，探针对小鼠生长没有不良影响。这些实验验证了探针的高生物安全性。
在本研究中，Hydro-J1050暴露于ROS后经历J-聚集过程，从分子状态转变为纳米颗粒。这种转化不仅实现了NIR-II荧光信号的产生，还可能实现探针在受损或发炎的肝脏和肺中更长的滞留时间。为证明这一点，研究人员在APAP诱导的肝损伤小鼠模型中测试了该探针在暴露于ROS后的滞留情况。并与不能形成J-聚集体的Hydro-IR783（一种商业NIR染料IR783的还原形式）的滞留时间进行了比较。对于腹腔注射100 mg/kg APAP引起肝损伤的小鼠，肝区荧光信号逐渐增强然后减弱，表明两种探针都能在体成像ROS。与hydro-IR783不同，Et-J1050形成纳米级J-聚集体，导致尺寸依赖性药代动力学和延长的肝脏滞留，原因是肾脏清除减少和网状内皮系统摄取增强。这些聚集体通过非共价自组装形成，预计会在体内逐渐解离并被代谢。在使用的成像剂量下，延长的肝脏滞留反映了清除行为的改变而非生物累积，未观察到明显的生物安全问题。显然，Hydro-J1050在滞留时间和发射波长方面优于Hydro-IR783。一方面，激活后，Et-J1050的纳米级聚集体在肝区的滞留时间比分子IR783更长，在病变部位更长的滞留时间具有多重优势，例如更强、更持久的信号、更大的成像时间安排灵活性、更好地检测缓慢或深层过程，以及改进定量分析的信号稳定性。另一方面，Et-J1050（激活后的探针）J-聚集体的最大荧光波长为1050 nm，远长于氧化后不能形成J-聚集体的IR783。
研究人员随后将探针应用于诊断小鼠模型中由肝缺血再灌注损伤引起的氧化应激。该模型通过夹闭供应小鼠中叶和左叶的门管三联体（肝动脉、门静脉和胆管）30或60分钟建立，然后移除夹子使血流恢复，再灌注24小时后进行成像。健康小鼠作为对照，经历60分钟缺血然后用N-乙酰半胱氨酸（一种肝损伤治疗药物）处理的小鼠作为治疗组。注射探针Hydro-J1050后不同时间点的代表性荧光图像和量化强度显示，对于对照组，注射后2小时观察到弱荧光，这可能是由肝脏正常生理条件下产生的ROS诱导的，因为肝脏代谢非常活跃，富含线粒体，是解毒的主要场所。相反，对于I/R30 min和I/R60 min组，注射传感器后30分钟在肝区观察到更强的荧光，并随时间逐渐增强，I/R60组的荧光强度强于I/R30组。这两个组由于氧化应激导致的肝脏中过量产生的ROS引起了荧光增强。对于用NAC处理的I/R小鼠，注射后60分钟在肝区出现荧光，并在随后的180分钟内保持微弱。NAC通过补充谷胱甘肽和清除自由基来消耗ROS并减少I/R病变中的氧化应激，因此，反映ROS水平的荧光强度降低。离体肝脏图像显示，来自I/R30 min和I/R60 min组的小鼠肝脏表现出更强的荧光，而治疗组的荧光弱得多，对照组几乎无荧光。肝组织切片的H&E染色图像验证了I/R过程诱导了肝组织损伤，表现为结构紊乱，肝细胞嗜酸性增加和局灶性核完整性丧失。该结果表明探针Hydro-J1050能够通过成像氧化应激来检测由缺血再灌注引起的肝损伤。
研究人员还使用Hydro-J1050进行了肺炎的荧光成像。在肺炎中，炎症剧烈，细胞因子激活更多免疫细胞，导致氧化应激和持续的ROS产生。健康小鼠（作为对照）以及肺部分别用5和10 mg/kg LPS处理的肺炎小鼠（仰卧位）的荧光成像显示，对于健康小鼠，在整个成像过程中（长达60分钟）未见荧光，而对于肺炎小鼠，注射探针后5分钟即可见荧光；用较高剂量LPS处理的小鼠肺部表现出更强的荧光，这与较高剂量LPS可引起更严重肺炎的事实相符。小鼠离体器官的荧光图像显示，只有LPS处理小鼠的肺部表现出荧光。
此外，还对俯卧位肺炎小鼠进行了荧光成像。在俯卧位，用5或10 mg/kg LPS处理的小鼠肺部荧光信号也清晰可见且更强。成像后，对不同组的小鼠实施安乐死，并取其肺脏进行H&E染色。结果显示，用5或10 mg/kg LPS处理的小鼠肺组织中观察到明显的肺泡空间塌陷，而对照小鼠的肺组织显示出完整的肺泡结构，表明LPS处理确实引起了肺损伤。
评估了探针Hydro
