李红霞|陈宇|魏丽红|吴鹏|方飞|李凤茹|刘碧霞|李淑华|何琼|周建文|唐可静|柯俊福
中国广东省广州市中山大学第一附属医院病理学系
摘要
背景
肺腺癌（LUAD）向小细胞肺癌（SCLC）的转化是一种罕见但已被充分记录的脱靶机制，与对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的获得性耐药性相关。然而，这种转化与形态变化之间的关系仍不甚清楚。本研究旨在阐明RB1缺失促进转化的分子机制，特别关注其在形态改变中的作用。
方法
在体外和体内RB1缺陷的LUAD模型中进行了综合分子、形态和结构分析。进一步通过功能干扰和药理学抑制RB1相关调节因子来阐明RB1/E2F1/HDAC1轴的机制。
结果
TP53和RB1表达水平低的LUAD患者表现出更强的肿瘤侵袭性及较差的临床预后。我们的发现表明，RB1缺失诱导了LUAD细胞的上皮-间质转化（EMT）特征，表现为纺锤形形态、vimentin表达增加和E-cadherin表达减少。此外，RB1丢失导致核异常，包括核标志物（如lamin A/C和emerin）分布不均，这加剧了肿瘤的侵袭性。通过下调RB1/E2F1/HDAC1复合体的各个组分，我们确定HDAC1是影响lamin A/C修饰和核变形的关键调节因子。HDAC1衍生物的药理学抑制可改善RB1缺失肺癌细胞中的核异常，提示其具有潜在的治疗策略。从机制上看，乙酰化lamin A/C的丢失导致其降解和颗粒状分布，从而影响核的机械稳定性和细胞骨架动态，这可能解释了观察到的EMT现象。
结论
总体而言，我们的发现表明，RB1下调通过HDAC1介导的lamin A/C去乙酰化显著影响LUAD的形态，促进EMT和核异常。未来的研究应优先开发旨在恢复RB1功能或抑制HDAC1的靶向疗法，以延缓癌症进展，从而优化TKI耐药LUAD患者的分层和治疗策略。
引言
肺腺癌（LUAD）约占非小细胞肺癌（NSCLC）的40%[1]，尽管靶向疗法取得了进展[2],[3]，但其全球发病率和死亡率仍在上升。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）已被广泛用作具有EGFR突变的高级NSCLC的一线治疗策略。然而，这些药物通常在治疗后9至14个月内出现耐药性[4]。已经确定了多种针对EGFR-TKIs的获得性耐药性的靶内和靶外机制，包括EGFR基因的二次突变和多种信号通路的激活[5],[6],[7]。LUAD向小细胞肺癌（SCLC）的组织学转化是一种已被充分描述的脱靶耐药机制[8],[9]，发生在约3%至14%的EGFR突变LUAD患者中[5],[8],[10]，这有助于细胞谱系的可塑性。大约三分之二的EGFR突变肺癌同时存在TP53突变，这与EGFR-TKI治疗的反应时间缩短和总体生存率降低相关[5],[11],[12]。更重要的是，EGFR突变肺癌中TP53和RB1的改变同时存在时，组织学转化的风险显著增加，25%的病例表现为新发SCLC或最终转化为小细胞表型[13]。尽管RB1和TP53的共同失活被认为是LUAD向SCLC转化的标志[13]，但这些遗传改变如何影响形态重编程的机制仍不甚清楚。值得注意的是，TP53突变克隆不会发生SCLC转化，这突显了RB1改变在促进组织学转化过程中的重要作用。然而，驱动这种形态变化的分子机制尚未阐明。越来越多的证据表明，细胞谱系的可塑性通常伴随着上皮-间质转化（EMT）和核结构的协调变化，这两者都反映了细胞适应性的增强[14]。然而，RB1丢失如何机制性地关联EMT相关的表型可塑性和LUAD-SCLC转化过程中的核变形仍需进一步研究。
重要的是，核包膜完整性和机械稳定性的改变日益被认为是EMT进展和细胞命运可塑性的关键决定因素，尤其是在侵袭性和发生谱系转化的癌症中。lamin A/C-Emerin复合体作为细胞形态的标志，在维持核完整性和细胞骨架耦合中起着关键作用[15],[16]。它调节大部分核质通讯，并在细胞迁移过程中抵抗压缩力。新兴证据表明，正常的表观遗传修饰紊乱会导致基因功能改变和恶性细胞转化[17]，这提示了一种潜在的分子机制。然而，RB1缺陷LUAD中lamin A/C动态的翻译后修饰情况尚未得到充分研究，特别是在LUAD谱系可塑性的背景下。组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）是RB1-E2F1抑制复合体的关键组成部分[18]，可能因其在调节lamin乙酰化状态中的作用而成为这一途径中的缺失环节。已有研究表明，lamin A/C直接与组蛋白去乙酰化酶（包括SIRT1[19]和SIRT6[20]）相互作用，而核包膜上的lamin伴侣（如emerin、BAF和LAP2beta）与HDAC3[21]或HDAC2[22]相互作用。此外，lamin A/C还参与维持RB和E2F的活性[23]。进一步的研究发现，通过HDAC1抑制靶向E2F1/RB/HDAC1轴可以阻止E2F1从复合体中释放，从而有效抑制结直肠癌的增殖[18]。lamin A/C在维持核结构和促进机械适应方面的双重作用表明，其被HDAC1去乙酰化可能导致核变形和形态变化。然而，目前尚无研究阐明HDAC1是否直接针对lamin A/C来介导RB1缺陷LUAD中的这些病理变化。
综上所述，RB1突变、形态重塑和lamin A/C的翻译后修饰之间存在明确的关联。我们的研究表明，由于RB1失活突变导致HDAC1从E2F1/Rb/HDAC1复合体中分离，HDAC1与lamin A/C相互作用，增强去乙酰化活性、核包膜解体和vimentin介导的细胞骨架重编程。这些发现不仅解决了关于谱系可塑性形态调节的长期争论，还突出了预防治疗抵抗性转化的潜在治疗靶点。
细胞系和细胞培养
A549和A549 RB1敲除（RB1-KO）细胞系购自中国广东省广州市的Ubigene公司，而H1975细胞系来自美国类型培养收集中心（ATCC）。常规检测确认所有细胞系均无支原体污染。H1975细胞系在RPMI-1640培养基（Gibco，美国）中培养，而A549和A549-RB1-KO细胞系在DMEM培养基（Gibco，美国）中培养。所有培养基定期更换。
LUAD患者中TP53和RB1表达水平低与预后不良相关
314名LUAD患者的临床特征详见补充表S1和S2，TP53和RB1的代表性免疫组化染色结果见图1A。LUAD中的TP53表达状态与临床分期、N分类和转移显著相关（补充表S1），而RB1表达仅与转移相关（补充表S2）。Kaplan-Meier分析进一步表明，TP53和RB1表达水平低的患者的预后较差。
讨论
在本研究中，我们探讨了TP53和RB1下调与LUAD预后不良之间的关联。我们的发现表明，RB1缺失通过HDAC1介导的lamin A/C去乙酰化促进了LUAD的谱系可塑性和核变形。从机制上看，RB1丢失通过纺锤形形态改变诱导EMT，并通过破坏lamin A/C-emerin轴导致核包膜异常。值得注意的是，我们的研究是……
结论
总之，本研究阐明了TP53和RB1下调在LUAD进展中的关键作用，将这些遗传改变与EMT和核异常联系起来。RB1/E2F1/HDAC1调节复合体的鉴定为针对LUAD侵袭性特征的靶向治疗干预提供了新的机会。我们的发现表明，RB1缺失触发HDAC1介导的lamin A/C去乙酰化及后续……
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无披露内容。
<作者贡献声明>
<声明竞争利益>
李红霞：撰写——原始稿件、研究、概念构思。
陈宇：撰写——审稿与编辑、撰写——原始稿件、概念构思。
魏丽红：研究、概念构思。
吴鹏：撰写——审稿与编辑。
方飞：撰写——审稿与编辑、撰写——原始稿件、方法学、概念构思。
李凤茹：方法学。
刘碧霞：撰写——审稿与编辑、研究。
李淑华：正式分析。
何琼：正式分析。
周建文：正式分析。
<致谢>
本工作得到了国家自然科学基金（82330065、30900650、81372501、81572260、81172232、31430030）和广东省/广州市科技计划（2023B1111020005、2023B03J0106、2021B1212040017、20170402094、2018A050506036、2020B1515120032）的支持。
