在癌症免疫治疗领域，免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）虽然为部分患者带来了革命性的生存获益，但仍有大量患者面临原发性或继发性耐药的困境。这种耐药性与肿瘤微环境中多种免疫抑制机制密切相关，其中自然杀伤细胞（Natural Killer cells, NK）和细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cells）的功能抑制是关键因素之一。NKG2A（Natural Killer Group 2, Member A）作为一种重要的抑制性受体，主要表达于NK细胞和部分CD8+T细胞表面。当它与肿瘤细胞表面表达的非经典主要组织相容性复合体I类分子HLA-E（Human Leukocyte Antigen-E）结合后，会启动抑制性信号传导，从而“刹车”免疫细胞的杀伤活性。因此，阻断NKG2A/HLA-E通路被视为增强现有免疫疗法疗效、扩大受益人群的潜在新策略。
目前进入临床研究的NKG2A抗体Monalizumab（Mona-IgG）是一种人源化抗体，其鼠源互补决定区（Complementarity-Determining Regions, CDRs）存在诱发抗药物抗体（Antidrug Antibodies）的风险，可能影响疗效。为了开发更优的NKG2A靶向疗法，研究人员开展了本研究，旨在发现和优化全人源NKG2A阻断抗体，并进一步创新性地构建了以NKG2A为靶点的双特异性衔接子（Bispecific Engagers, BiNKs），系统评价其在激活免疫细胞、杀伤肿瘤方面的潜力。这项研究成果发表在《科学·进展》（SCIENCE ADVANCES）杂志上。
为开展研究，作者运用了几项关键技术：通过竞争性噬菌体展示和酵母展示技术从全人源抗体库中筛选并亲和力成熟获得高特异性抗NKG2A抗体；利用生物层干涉术（Biolayer Interferometry, BLI）和酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）表征抗体结合特性；采用乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）释放实验、流式细胞术和蛋白质印迹（Western Blot, WB）分析抗体和BiNK分子对来自健康供体外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的NK细胞和CD8+T细胞的激活、细胞因子分泌及信号通路的影响；并最终在植入人PBMC的NSG（NOD-scid gamma）小鼠肺癌异种移植模型中验证体内抗肿瘤效果。
研究结果
1. 1B2克隆可区分NKG2A和NKG2C并抑制HLA-E相互作用
研究人员采用竞争性噬菌体筛选策略，以CD94/NKG2A异源二聚体为靶点，成功分离出两株全人源Fab克隆（1B2和2A8）。其中，1B2能特异性结合CD94/NKG2A，而不结合激活型受体NKG2C。将其改造成IgG格式（1B2 IgG）后，证实其可浓度依赖性地阻断可溶性HLA-E（sHLA-E）四聚体与CD94/NKG2A的结合，但效力低于对照抗体Mona-IgG。
2. 通过酵母展示进行亲和力成熟获得了效力更强的抗NKG2A克隆1B2-6
为了提升阻断效力，研究人员对1B2进行了亲和力成熟。通过构建单链Fab（scFab）酵母库并进行可变区置换，获得了亲和力增强的克隆1B2-6。1B2-6与CD94/NKG2A的结合亲和力提高了约2倍，其阻断HLA-E结合的半数抑制浓度（IC50）与Mona-IgG相当。表位定位研究发现，NKG2A蛋白第170位的丝氨酸（S170）是1B2、1B2-6和Mona-IgG结合的关键残基。
3. NKG2A阻断抗体激活原代人NK细胞
在体外实验中，1B2-6和Mona-IgG处理能显著激活CD56dimNKG2A+NK细胞，表现为干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）和颗粒酶B（Granzyme B, GrzB）阳性细胞比例增加。这种激活效应在与表达HLA-E的肺癌细胞H2030共培养时也能观察到。信号通路分析表明，1B2-6可能通过调节c-Abl/pCrk轴而非SHP-1依赖的途径来部分解除NKG2A的抑制信号。
4. NKG2A阻断抗体增强肿瘤抗原特异性IgG1抗体的ADCC效应
研究人员评估了NKG2A抗体与靶向EGFR（西妥昔单抗，Cetuximab）、HER2（帕妥珠单抗，Pertuzumab）和CEACAM5（1G9 IgG1）的IgG1抗体联用的效果。结果表明，1B2-6和Mona-IgG均能显著增强这些IgG1抗体对表达HLA-E的肿瘤细胞（如A549, H2030, NCI-H660）的ADCC活性，但对HLA-E阴性的293T细胞无效。值得注意的是，NKG2A抗体单用虽能诱导细胞因子分泌，但不足以引发肿瘤细胞裂解，强调了肿瘤靶向抗体在形成有效杀伤免疫突触（Immune Synapse, IS）中的必要性。
5. 靶向NKG2A的双特异性衔接子（BiNK）通过同时靶向NKG2A和肿瘤抗原诱导NK细胞介导的肿瘤细胞杀伤
研究团队创新性地构建了双特异性分子BiNK，将靶向肿瘤抗原（如EGFR或HER2）的单链抗体片段（scFv）与抗NKG2A抗体1B2的轻链N端融合。BiNK能同时结合NK细胞上的NKG2A和肿瘤细胞上的靶抗原，有效促进免疫突触形成，并导引NK和CD8+T细胞对肿瘤细胞产生特异性杀伤。这种杀伤作用依赖于肿瘤抗原的表达。
6. BiNK介导NK细胞毒性的机制研究
机制探讨发现，BiNK能诱导NK细胞分泌IFN-γ、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）和GrzB。双价（Bivalent）的BiNK或1B2-6 IgG能有效激活NK细胞，而单价（Monovalent）Fab或过高价态（如多价珠状复合物）则效果不佳甚至产生抑制。BiNK处理还能上调NK细胞表面CD16A的表达，并诱导NKG2A受体的内化（Internalization），这可能是其增强活性的另一机制。尽管BiNK可能引起NKG2A簇集并激活部分抑制信号（如pSHP-1增加），但其同时募集的激活信号（如pVav1增加）足以驱动细胞杀伤。
7. NKG2A阻断抗体和BiNK在体内表现出强大的抗肿瘤功效
在植入人PBMC的NSG小鼠A549肺癌模型中，抗HER2 × 抗NKG2A BiNK单药或与帕妥珠单抗联用，均能显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期。细胞清除实验证实，BiNK的抗肿瘤活性同时依赖于NK细胞和CD8+T细胞。与无效治疗组相比，有效治疗组（BiNK及其组合）能更好地维持外周血中的人NK细胞数量，并观察到CD8+T细胞的扩增。
研究结论与意义
本研究表明，通过噬菌体和酵母展示技术获得的完全人源NKG2A阻断抗体（1B2, 1B2-6）能够有效解除NKG2A/HLA-E介导的免疫抑制，增强NK细胞功能及其介导的ADCC效应。更重要的是，研究首次报道了以抑制性受体NKG2A为靶点的双特异性衔接子（BiNK）的概念验证。BiNK分子能够通过“桥接”免疫细胞（NK细胞和CD8+T细胞）与肿瘤细胞，直接引导其产生强大的抗肿瘤细胞毒性，在临床前模型中显示出显著疗效。
该研究的成功为癌症免疫治疗提供了新的思路和工具。与传统的以激活型受体（如CD16A）为靶点的细胞衔接器相比，靶向NKG2A的BiNK具有潜在优势：可同时调动NK和T细胞两种核心效应细胞；不干扰机体固有的抗体Fc段功能；可能更适合于肿瘤微环境中NKG2A高表达、CD16表达下调的免疫细胞群体。这些全人源NKG2A抑制剂和新型BiNK分子有望进一步开发成为针对实体瘤的下一代免疫治疗药物，为对现有免疫检查点抑制剂耐药的患者提供新的希望。
