Marine Michon | Sebastien Curpanen | Ombeline Pessey | Robert Thai | Jean-Charles Gaillard | Gaëtan Herbette | Karen Hinsinger | Daniel Gillet | Jean Armengaud | Jean-Christophe Cintrat | Julien Barbier
巴黎萨克雷大学，CEA，INRAE，健康药物与技术（MTS），SIMoS，法国吉夫-叙尔-伊韦特，91191
摘要
靶向蛋白水解的嵌合体在药物研究中引起了越来越多的关注，这得益于它们具有催化性和不可逆的作用机制，能够作用于以前被认为“无法用药物处理”的蛋白质。这些双功能分子通过招募E3连接酶（如CRBN或VHL）来劫持细胞的泛素-蛋白酶体系统，从而诱导目标蛋白质的选择性降解。它们的有效性已经在多种疾病中得到验证，几种化合物已经进入了一至三期临床试验阶段，进一步增强了其吸引力。在对抗毒素方面，已经开发出了Retro-2分子的衍生物（对志贺毒素、蓖麻毒素和多种病原体具有活性）。这些分子通过干扰病原体的细胞内运输来发挥作用，特别是针对Sec16A和/或ASNA1蛋白。我们的研究介绍了基于PROTAC技术的新化学探针的合成和表征，这些探针结合了来自沙利度胺的CRBN配体、Retro-2衍生物以及可变长度的PEG链接头，以更好地理解Retro-2衍生物的作用机制。与最初的假设相反，我们的研究结果表明，这些分子并不会依赖蛋白酶体来降解目标蛋白质，而是证明了PEG-2分子能够在PEG接头通常锚定在邻苯二甲酰亚胺环的4位的情况下降解翻译终止因子GSPT1。此外，本研究首次表明GSPT1的降解取决于柔性PEG链接头的长度。
引言
近年来，PROTACs已成为药物发现领域的重要研究方向。其吸引力主要源于PROTACs的催化性和不可逆作用机制，以及它们能够靶向以前被认为无法用药物处理的细胞内蛋白质[1]。实际上，这些化合物通过招募已充分研究的E3连接酶（主要是cereblon（CRBN）或Von Hippel–Lindau（VHL）蛋白，来诱导目标蛋白质的降解。从结构上看，PROTACs是由E3连接酶配体和一个特异性结合目标蛋白质的“弹头”组成的双功能分子。它们的有效性已经在体外和体内多种病理条件下得到验证，包括癌症[2]、自身免疫性疾病[3]和神经退行性疾病[4]。
此外，已有几种成功的PROTACs化合物进入了三期临床试验阶段[5]，这显著提升了PROTACs在工业界和学术界的吸引力。在PROTAC-DB数据库中，65%的PROTACs被修饰了免疫调节药物（IMiDs），如沙利度胺、泊马度胺或来那度胺。目前正在进行临床试验的化合物中，这一比例上升到了74%[6]、[7]。历史上，IMiDs被认为能够在CRBN和新底物之间起到“分子粘合剂”的作用，从而导致新底物的降解[8]。在PROTAC开发过程中，这些现象被视为脱靶降解现象，人们投入了大量努力来利用蛋白质组学[9]、泛素组学和相互作用组学[11]以及计算研究[12]来识别这些新底物及其可能的不良影响。具体来说，翻译终止因子GSPT1（也称为eRF3a）是某些cereblon调节化合物（如CC-885[13]或CC-90009[14]、[15]）的已知靶标。其降解作用是通过分子粘合剂效应实现的，从而阻断蛋白质的生物合成，产生细胞毒性[16]。
除了治疗应用外，PROTACs还可以作为化学探针来阐明作用机制并识别蛋白质靶标。这种方法已经在天然产物的靶标鉴定中得到了成功应用[17]。利用这种方法，已经发现了celastrol[18]、青蒿素[19]、lathyrane[20]、evodiamine[21]、索拉非尼[22]以及Hedgehog通路抑制剂-1[23]的多个靶标。
作为体外和体内抗毒素分子开发的一部分，通过高通量筛选鉴定了Retro-2化合物[24]，并通过结构-活性关系研究开发出了更具活性的衍生物（如Retro-2.1[25]、[26]）。除了对志贺毒素和蓖麻毒素的活性外，这类分子还被证明对多种病原体有效，包括病毒[27]、[28]、[29]、[30]、细胞内细菌[31]和寄生虫[32]、[33]。这些分子并不直接作用于病原体，而是通过干扰病原体的细胞内运输来影响宿主细胞。文献中提到，Sec16A和ASNA1（也称为GET3）是Retro-2的靶标蛋白，并与两种不同的细胞效应模型相关联[34]、[35]。
在这项工作中，我们合成了基于PROTAC技术的新化学探针。这些PROTAC分子由一个招募CRBN E3连接酶的配体、一个与目标蛋白质结合的Retro-2衍生物以及连接这两个组分的聚乙二醇（PEG）接头组成。与遗传学方法相结合，这些小分子的开发旨在更深入地探讨Retro-2衍生物的作用机制。
部分内容
设计与化学合成
为了降解Retro-2的两个目标蛋白Sec16A和ASNA1，设计了六种化学探针。在设计PROTAC分子之前，需要评估这些蛋白质的PROTACability，即它们被此类降解剂降解的易感性。Schneider等人[36]首次描述了蛋白质的PROTACability，主要取决于是否存在泛素化位点（i.e）、相对较长的周转率以及最佳条件
结论
本研究基于六种PROTAC类似物的合成和生物活性评估，尽管这些分子与目标蛋白有相互作用，但并未证明它们能够选择性地降解Retro-2的目标蛋白。然而，与最初的预期相反，我们发现当使用柔性PEG接头时，这些分子能够降解GSPT1，并且PEG链越短，这种能力越强。
此外，
材料与方法
所有用于合成的试剂和溶剂均来自商业渠道，为试剂级，无需进一步纯化即可使用。反应通过薄层色谱（TLC）和HPLC/MS进行监测。TLC在预涂层的60F254硅胶板上进行，有机化合物在254纳米紫外光下可视化。
LC/MS分析在Bruker公司的二元洗脱HPLC系统上进行，该系统连接了一个带有Amazon-SL离子阱的质量谱仪。
作者贡献声明
Julien Barbier：撰写——初稿，可视化，监督，项目管理，资金获取，概念构思。
Marine Michon：撰写——初稿，可视化，方法学，研究，数据分析。
Sebastien Curpanen：撰写——审阅与编辑，研究。
Ombeline Pessey：撰写——审阅与编辑，验证，研究，数据分析。
Robert Thai：撰写——审阅与编辑，研究。
Jean-Charles Gaillard：撰写——审阅与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
数据可用性
质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴关系库存储在ProteomeXchange联盟中，数据集标识符为PXD069615。审稿人可以使用用户名reviewer_pxd069615@ebi.ac.uk和密码RPQX7HZqfAbB访问该私有数据集；或者，也可以使用项目访问号PXD069615和令牌dlvPlGPVVNMc进行访问。
最终化合物的NMR数据已存入相应数据库。
致谢
本工作得到了法国跨部门CBRN-E研发计划（Agence Innovation Defense）的支持，并得到了国家研究机构（ANR-20-CE18-0016-01 SMERSEC和ANR-20-SEBM-0001-01 PLANT）的资助。作者感谢Sabrina Lebrequier和David-Alexandre Buisson在分析方面提供的支持。同时，我们也感谢巴黎萨克雷大学（CNRS）天然物质化学研究所（ICSN）生物与结构化学RMN实验室的Giraud François的支持。
