在生命活动的复杂交响中，活性硫物种（Reactive Sulfur Species, RSS）犹如一支不可或缺的乐章，其中氢硫化物（H2S）作为知名的气体信号分子，其生理功能已被广泛研究。然而，科学探索的脚步从未停歇，研究者们逐渐将目光投向了H2S的氧化衍生物——过硫化氢和多硫化氢（H2S2/H2Sn）。这些分子拥有比H2S更强的反应活性，能够直接诱导蛋白质半胱氨酸残基发生S-过硫化修饰（S-persulfidation），从而精细调控多种酶的活性，在氧化还原信号传导和细胞调控中扮演着关键角色。例如，低至30 nmol/L的H2S2/H2Sn即可有效触发星形胶质细胞的钙离子内流，其效力远超H2S。这引发了一个深层次的思考：那些过去被归功于H2S的生物学功能，是否部分是由生理条件下存在的痕量H2S2/H2Sn所介导的？
然而，揭开这些神秘分子的面纱面临着巨大挑战。由于H2S2/H2Sn在生物体内浓度极低（高纳摩尔至低微摩尔水平），且所处环境充满大量其他活性硫物种的干扰，传统的检测方法如紫外-可见光谱、色谱和质谱等，难以实现对其活体、实时、高灵敏度的特异性检测。尽管已有一些荧光探针被开发出来，但它们普遍存在灵敏度不足、易受其他RSS交叉反应干扰、以及探针分子本身在复杂生物环境中稳定性差等问题，导致无法准确区分和定量痕量的目标分子，甚至产生假阴性结果。因此，开发一种能够在高背景干扰下，对H2S2/H2Sn实现超灵敏、高选择性、实时追踪的检测工具，成为推动该领域发展的迫切需求。
为了攻克这一难题，中国药科大学的研究团队在《Acta Pharmaceutica Sinica B》上发表了他们的最新研究成果。他们设计并合成了一系列基于生物正交化学原理的新型荧光探针工具包——Cyne-1至Cyne-5。这项研究旨在解决现有探针技术的瓶颈，为在生理和病理条件下精确解析H2S2/H2Sn的动态变化、揭示其生物学功能提供强大的技术武器。
为开展此项研究，作者主要运用了几项关键技术：基于Mitsunobu反应的一步法合成策略，高效构建了以醚键连接环辛炔弹头与多样化荧光团（覆盖蓝色至近红外光谱）的探针分子；通过系统的光物理性质表征（包括紫外-可见吸收光谱和荧光光谱分析）评估探针的灵敏度、选择性和稳定性；利用共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞术进行细胞水平的成像与定量分析；最后，借助小动物活体成像系统（PerkinElmer IVIS®）在BALB/c小鼠模型中实现了外源性和内源性H2S2/H2Sn的可视化追踪。
研究结果部分详细展示了该探针平台的卓越性能及其应用价值：
2.1. 醚键探针的设计与合成
研究人员摒弃了传统的酯键或氨基甲酸酯键连接方式，创新性地采用化学和酶稳定性更优的醚键来连接环辛炔反应基团和荧光团。通过高效的Mitsunobu反应，他们成功合成了五种发射光谱覆盖蓝光到近红外的探针（Cyne-1至Cyne-5）。这种模块化设计不仅合成简便，而且为适应不同的实验需求（如深组织穿透、低背景自发荧光）提供了灵活的选择。
2.2. 醚基探针Cyne-1–5的光物理性质
由于醚键的引入有效抑制了分子内电荷转移，探针本底荧光极低。在与H2S2/H2Sn反应时，探针表现出惊人的灵敏度和响应速度。例如，Cyne-1在5分钟内即可实现1018倍的荧光增强，最终达到1289倍。所有探针均表现出极低的检测限，其中Cyne-4的检测限低至3.3 nmol/L，远超以往报道的探针。对照实验表明，探针的激活高度依赖于环辛炔结构，其他类似物（如基于环辛烯或直链炔烃的分子）均无显著响应。
2.3. 对H2S2/H2Sn的选择性
选择性测试表明，Cyne探针系列对H2S2/H2Sn具有高度特异性，即使在高浓度其他活性氧、活性氮、活性硫物种、氨基酸、金属离子或复杂生物体液存在下，也几乎不受干扰。特别值得注意的是，探针能够特异性地检测到由H2S与活性氧（如次氯酸盐）原位反应生成的H2S2/H2Sn，凸显了其在模拟生理氧化环境中的应用潜力。
2.4. Na2S溶液中痕量H2S2/H2Sn的检测
一个关键的发现是，即使在单纯的Na2S溶液中，Cyne探针也能检测到微弱的但持续的荧光增强。通过在不同水质（PBS、去离子水、自来水）中的对比实验，以及使用还原剂TCEP（三(2-羧乙基)膦）进行验证，研究人员确证了这一信号来源于Na2S在环境中缓慢氧化生成的痕量H2S2/H2Sn，估算其生成速率约为每小时0.43%–0.48%。这一发现为重新审视H2S相关生物学效应的分子基础提供了重要线索。
2.5. 活细胞中外源性H2S2/H2Sn的成像与表征
在4T1活细胞中，所有Cyne探针均能有效进入细胞，并在外源性加入Na2S2后产生强烈的荧光信号，而对其他硫化物（如谷胱甘肽GSH、半胱氨酸Cys、S8、Na2S）处理则无明显响应，证明了探针在细胞环境下的高选择性和生物相容性。
2.6. 通过ROS介导的氧化作用监测细胞内H2S衍生的H2S2/H2Sn形成
研究进一步利用课题组前期开发的硫代羧酸类H2S前体药物，在细胞内可控地释放H2S。当与不同活性氧共同处理细胞时，探针成功捕获到由内源释放的H2S经ROS氧化生成的H2S2/H2Sn信号，且信号强度依赖于ROS的种类和浓度（如ClO-的效率远高于H2O2）。使用酯酶抑制剂PMSF可阻断此过程，证实了信号来源于前药水解产生的H2S。
2.7. 细胞内源性H2S2/H2Sn产生的定量检测
在HEK293T细胞中，利用D-半胱氨酸（D-Cys）刺激内源性H2S2/H2Sn生成的经典模型，通过流式细胞术定量分析表明，Cyne-2探针能够灵敏地检测到由D-氨基酸氧化酶（DAO）代谢D-Cys所产生的H2S2/H2Sn，且响应呈浓度依赖性。使用DAO抑制剂苯甲酸钠可完全抑制该信号，而L-半胱氨酸的效应远弱于D-半胱氨酸，验证了该途径的立体专一性。
2.8. BALB/c小鼠中外源性和内源性H2S2/H2Sn的活体成像
在小鼠活体层面，近红外探针Cyne-5成功实现了对腹腔注射的外源性Na2S2的高选择性、快速荧光成像。同时，在脂多糖（LPS）诱导的炎症模型小鼠中，探针也清晰地检测到了内源性升高的H2S2/H2Sn信号，展示了其在病理生理条件下的应用前景。
2.9. 探索不同空间位阻过硫化物的反应性
该研究的一个理论突破在于系统探讨了过硫化物（RSSH）的自歧化反应动力学与其空间位阻的关系。合成了三种具有不同位阻的过硫化物前体（Pre-PenSSH, Pre-tBuSSH, Pre-EtSSH）。实验发现，位阻较小的过硫化物（如EtSSH）更容易通过自歧化反应产生H2S2/H2Sn，而位阻较大的（如PenSSH）则相对稳定。然而，当存在H2S时，H2S可通过转过硫化反应促进所有类型的过硫化物（尤其是位阻大的）产生H2S2/H2Sn。这一发现揭示了过硫化物反应活性的空间位阻控制规律。
2.10. 实时监测细胞内蛋白质S-过硫化水平
最后，研究团队创新性地提出，通过监测H2S2/H2Sn的水平可以间接反映细胞内整体蛋白质S-过硫化的动态变化。他们利用已知的过硫化物供体JPT-1，在溶液和H9c2心肌细胞中验证了这一设想。探针Cyne-5能够灵敏地检测到由JPT-1在生物硫醇作用下释放过硫化物，进而降解产生的H2S2/H2Sn信号升高。这为弥补传统Tag-Switch技术只能进行终点分析的不足，实现活细胞内蛋白质S-过硫化水平的实时、非侵入性监测提供了新方法。
综上所述，本研究成功开发了一套性能卓越的H2S2/H2Sn特异性荧光探针工具箱。该工具不仅解决了现有检测技术灵敏度低、选择性差和稳定性不足的核心难题，更凭借其超高性能，首次直接证实了生理条件下H2S自发氧化生成痕量H2S2/H2Sn的现象，并深入揭示了过硫化物反应活性受空间位阻调控的新规律。此外，研究还开创了通过监测H2S2/H2Sn动态来间接评估蛋白质S-过硫化水平的新策略。这些成果极大地推进了过硫化物的化学生物学研究，为深入探索H2S2/H2Sn在疾病机制（如炎症、糖尿病、铁死亡等）中的作用和开发相关治疗策略提供了强大的、具有转化潜力的研究工具。
