Blinatumomab驱动αβ和γδ T细胞亚群的活化：来自体外实验的启示
Blinatumomab（BLN）是一种双特异性T细胞衔接器（BiTE），通过同时结合B细胞上的CD19和T细胞上的CD3，触发靶细胞依赖性的T细胞活化，从而裂解CD19+的B细胞前体急性淋巴细胞白血病（BCP-ALL）细胞。尽管BLN在临床上取得了显著成功，但其治疗应答或失败的免疫学机制仍未完全阐明。γδ T细胞因其强大的细胞毒性、抗原呈递能力、对多种肿瘤实体的广泛裂解作用以及低同种异体反应性，成为过继性T细胞治疗的有吸引力的候选者。由于γδ T细胞也能被BLN重定向，本研究系统地比较了来自健康供体的常规αβ T细胞和非常规γδ T细胞在BLN驱动下的体外效应功能。
BLN增强新鲜αβ和γδ T细胞的细胞毒性，但αβ T细胞主导早期杀伤
研究首先评估了BLN诱导的新鲜分离的γδ、CD4+和CD8+αβ T细胞群体对CD19+靶细胞的杀伤作用。在效应器与靶细胞比例（E:T）为5:1、BLN浓度为20 ng/ml的条件下共培养3天后，所有共培养体系中CD19+靶细胞均持续减少。然而，与CD8+和CD4+αβ T细胞相比，γδ T细胞显示出较低的细胞溶解活性，表现为在BLN存在下，γδ T细胞培养物中仍有CD19+靶细胞持续存在。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，在BLN处理的培养物中，干扰素-γ（IFNγ）、颗粒酶B（GrzB）、穿孔素（Prf）和颗粒溶素（Gnly）的分泌均显著增加，其中αβ T细胞的释放水平始终高于γδ T细胞。总体而言，BLN增强了新鲜分离的γδ和αβ T细胞群体的细胞毒性潜力，但αβ T细胞群体，尤其是CD8+T细胞，表现出优于γδ T细胞的BLN介导的细胞溶解活性。
活化的γδ T细胞在有利的抗原条件下达到与αβ T细胞相当的细胞毒性
考虑到唑来膦酸（Zole）活化的Vδ2 T细胞已知的细胞毒性潜力及其潜在的临床应用，研究接下来评估了Zole扩增的Vγ9Vδ2 γδ T细胞系在BLN依赖下的杀伤作用，并与植物血凝素（PHA）扩增的αβ T细胞进行了比较，使用的靶细胞是CD19表面密度不同的两种BCP-ALL细胞系（HAL-01和NALM-6）。在E:T比为5:1、BLN浓度为20 ng/ml的条件下，活化的γδ和αβ培养物均导致CD19+显著减少，但PHA扩增的αβ T细胞诱导了略更显著的B细胞杀伤，几乎完全清除了CD19+细胞。有趣的是，研究观察到CD3下调选择性地发生在PHA扩增的αβ T细胞中，而Zole扩增的γδ T细胞保持了稳定的CD3表达。两种扩增的T细胞系在BLN刺激和肿瘤细胞存在下，IFNγ、GrzB、可溶性FAS配体（sFAS-L）和Prf的分泌均增加。与Zole扩增的培养物相比，PHA扩增的培养物中IFNγ和GrzB水平较低。值得注意的是，与Zole扩增的γδ T细胞相比，PHA扩增的αβ T细胞培养物中sFAS-L水平更高，这通常在T细胞过度活化导致的活化诱导细胞死亡（AICD）过程中出现。因此，当比较Zole和PHA活化的T细胞培养物时，αβ T细胞表现出更优的细胞毒性，但释放更高水平的sFAS-L，并且与γδ T细胞相反，出现了CD3下调。
靶抗原密度/肿瘤负荷共同影响γδ T细胞疗效；较高BLN剂量在应激条件下优先使γδ T细胞获益
在临床环境中，对BLN的应答很大程度上取决于白血病原始细胞计数。BLN对CD19具有更高亲和力，对CD3亲和力较低。因此，CD19靶点表达、靶细胞负荷以及BLN浓度可能影响T细胞信号传导和活化。研究接下来探讨了改变效应器与靶细胞比例和BLN浓度如何影响γδ T细胞的细胞毒性。使用CD19抗原密度高于NALM-6的HAL-01细胞系，在低肿瘤负荷（E:T 5:1，类似微小残留病MRD状态）和高肿瘤负荷（E:T 1:5，类似诊断/复发状态）条件下培养Zole扩增的γδ T细胞系。在低肿瘤负荷下，γδ和αβ培养物均能有效清除CD19+靶细胞。在高肿瘤负荷下，αβ T细胞的细胞毒性在24小时时似乎已接近最大，并且不随BLN浓度升高而增加，而γδ T细胞的杀伤效果在20 ng/ml BLN下有所改善，特别是在第3天。与之前的发现一致，显著的CD3下调主要出现在αβ T细胞中，尤其是在高肿瘤负荷条件下。因为CD3下调仅发生在高肿瘤负荷下，并且在相同的BLN和染色条件下主要影响αβ T细胞而 spared γδ T细胞，这种模式与强T细胞刺激后的CD3内化一致，而非表位掩蔽。
Zole扩增的γδ T细胞在BLN作用下保持稳定的效应记忆表型且检查点表达低
αβ和γδ T细胞中观察到的差异性CD3调节表明BLN通过CD3介导的信号传导存在差异，推测这会导致表型和功能差异，影响其适应性以及对AICD的易感性。为了研究这一点，比较了来自5名健康供体的Zole和PHA扩增的T细胞在基线（共培养前）的组成和表型，并在第1天和第3天分析了其数量和表型变化。在共培养前第14天的基线水平，Zole扩增的Vδ2 γδ T细胞显示出高度均一的效应记忆（EM）表型（CD27-CD45RA-）。它们的绝对细胞计数在不同BLN浓度和高ALL负荷下的三天共培养期间没有显著变化。第14天Zole扩增的γδ T细胞表达高水平的活化标志物（CD38、HLA-DR、DNAM-1、CD56），而衰竭标志物如TIGIT的表达水平较低或缺失。在共培养期间，它们的表型与基线相比没有显著变化。相比之下，PHA扩增的CD8+αβ T细胞在基线时更为异质，包含初始和记忆亚群。在BLN刺激下，特别是在高肿瘤负荷背景下，初始细胞减少，EM和终末分化效应记忆细胞（TEMRA, CD27-CD45RA+）亚群在24小时后增加，到第3天时EM细胞占主导地位。表型上，PHA扩增的CD8+αβ T细胞对BLN表现出强烈的活化反应，其特征是CD25和HLA-DR表达增加，与观察到的从初始表型向记忆表型的分化一致。TIGIT在αβ T细胞基线时表达显著较高。
BLN在混合PBMC培养物中扩增CD4+和CD8+T细胞，而非γδ T细胞
接下来研究在混合PBMC背景下，BLN处理是否能诱导γδ T细胞与αβ T细胞一同增殖。将PBMC与CD19+HAL-01以E:T比为1:1（高CD19+负荷）、5:1（中CD19+负荷）以及不添加CD19表达细胞系（低CD19+负荷，仅自体B细胞）共同培养7天，并添加或不添加20 ng/ml BLN。评估了共培养第0、3、7天时CD4+、CD8+和γδ T细胞的绝对细胞计数。发现在所有三种培养条件下（低、中、高CD19+负荷），BLN处理均导致CD4+和CD8+T细胞显著扩增。与CD4+和CD8+T细胞相反，在BLN处理下，直至第7天未观察到PBMC中γδ T细胞的显著扩增。有趣的是，在第3天，与中、低靶细胞密度的条件相比，高靶细胞密度存在下，CD4+和CD8+T细胞的扩增率更高。到第7天，CD4+T细胞在这些条件间无差异。然而，在CD8+T细胞中，基线时CD19+细胞最高的培养物在第7天的CD8+T细胞计数低于CD19+细胞频率中、低的培养物。总之，BLN应用在存在其他T细胞群体的情况下并未导致γδ T细胞扩增，CD8+T细胞是扩增最多的亚群，并且靶负荷与绝对CD8+T细胞计数呈负相关，提示强活化后发生了活化相关的收缩。
单细胞RNA测序揭示αβ T细胞中强烈的活化/衰竭程序
为了在单细胞分辨率下比较BLN刺激后αβ和γδ T细胞的转录谱，使用BD Rhapsody™平台和针对T细胞应答关键基因的人类T细胞面板，对一名健康供体的T细胞进行了靶向单细胞RNA测序。将一名健康供体的PBMC（含自体B细胞）在有或无BLN（20 ng/ml）条件下培养3天。随后，通过阴性分选分离CD3+T细胞进行测序。UMAP投影显示，BLN处理（红色）和未处理（灰色）条件之间存在明显分离，表明BLN刺激后转录组谱发生重大转变。UMAP投影显示，BLN暴露后，γδ T细胞（主要是Seurat集群6和13）的转录组变化极小，-BLN和+BLN细胞间有大量重叠。相比之下，αβ T细胞，尤其是CD8+T细胞，重新分布到BLN富集区域，并上调了增殖/效应和衰竭相关特征。BLN刺激导致与增殖和效应功能相关的基因以及衰竭标志物（包括TIGIT、TIM-3（HAVCR2）、LAG3和CD160）的表达增加。相反，γδ T细胞频率基本保持稳定，与表型数据一致，并与体外实验中第3天未观察到γδ T细胞从PBMC扩增的结果相符。值得注意的是，在转录水平上，γδ T细胞在BLN暴露后也不表达衰竭标志物TIGIT。
讨论
BLN是一种高效的双特异性T细胞衔接器，可将T细胞介导的细胞毒性导向表达CD19的恶性原始细胞和正常B细胞。本研究通过直接比较静息和活化的表达CD3的常规αβ T细胞（CD4+和CD8+）和非常规γδ T细胞，评估了它们在BLN刺激下的细胞毒性功能和表型转变。
本研究显示，BLN能有效地重定向αβ和γδ T细胞亚群对CD19+靶细胞的细胞毒性。然而，新鲜分离的γδ T细胞对CD19+肿瘤细胞的BLN介导的细胞毒性低于αβ T细胞。因为BLN结合的是CD3ϵ而非TCR可变区，αβ和γδ T细胞在BLN作用下的差异可能反映了CD3表位/克隆生物学以及CD3糖基化的不同。此外，谱系特异性信号传导也可能起作用。在αβ T细胞中，CD8+T细胞对BLN的反应比CD4+T细胞更强，这与先前报道一致。总的来说，这些发现支持了体内CD8+T细胞是BLN治疗应答的主要贡献者这一观点。鉴于血液中γδ T细胞频率较低，这些细胞在混合培养物中很容易被αβ细胞竞争掉，这可能是导致体外观察到γδ T细胞扩增极少的原因之一。
相比之下，经Zole体外活化和扩增的γδ T细胞系（其选择性扩增Vγ9Vδ2 γδ T细胞亚群）表现出与PHA扩增的αβ T细胞相当的细胞毒性功效。在所有实验中，抗原密度和肿瘤负荷是效力的主要调节因素，而BLN剂量进一步调节γδ T细胞活性。在低肿瘤负荷（模拟ALL中的MRD setting）下，Zole扩增的γδ和PHA扩增的αβ T细胞均能清除CD19+靶细胞；而在高肿瘤负荷（类似诊断/复发状态）下，αβ T细胞能快速清除CD19+靶细胞，而γδ T细胞的杀伤效果随时间推移在较高BLN浓度下得到改善。这些数据并不表明γδ T细胞本质上无法对CD3衔接器产生反应；相反，在测试条件下，BLN在αβ T细胞中引发的反应比在γδ T细胞中更强。它们显示了BLN刺激的γδ T细胞的效力，以及αβ细胞对BLN的反应比γδ细胞更强烈，但代价是过度活化的风险更高。
研究显示，BLN在αβ T细胞中触发了持续的细胞表面CD3下调，而在γδ T细胞中则没有，尤其是在高靶负荷下，并且伴随着αβ培养物中持续较高的sFas-L释放。高疾病负荷会放大BLN驱动的免疫突触频率和CD3信号传导，这可能使αβ T细胞易发生早期AICD。这种水平的TCR-CD3结合已知会诱导CD3下调（内化和ζ链降解），并在再刺激时触发Fas/FasL介导的AICD。因此，在αβ T细胞（特别是CD8+）中观察到较高的sFas-L分泌以及早期的CD3下调，与活化增强一致，并提示在高靶负荷下对Fas/FasL相关凋亡的易感性更高。然而，这些实验并未直接量化AICD，需要在未来研究中通过早期时间点（例如Annexin V/活性caspase-3）的直接凋亡测量来正式验证这一机制。此外，从活化T细胞和混合PBMC培养物的共培养中观察到的在较低靶负荷下优先的CD8 T细胞扩增也支持了这一假设。临床上，同样的原理是BLN在较低白血病负荷下疗效更优、使用减瘤治疗以及BLN常用于MRD setting和作为异基因移植桥梁的基础。这共同表明，高CD19负荷加速了αβ活化但限制了CD8+扩增，而Zole扩增的Vγ9Vδ2 γδ T细胞在这些条件下保留了CD3并维持了表面CD3表达；这是否反映了对AICD的易感性降低需要直接测试。
重要的是，第14天的Zole扩增γδ T细胞表现出效应表型，且抑制性检查点表达低。相反，PHA扩增的αβ T细胞经历了快速的活化和从初始向EM的分化。来自一名供体的单细胞RNA测序支持这些发现：αβ细胞获得了增殖和活化/衰竭程序，而γδ细胞显示出相对温和的转录转变。需要更大的样本集来验证这些发现。
在本研究的实验中，γδ培养物在发挥细胞毒性效应功能的同时，产生的IFNγ和细胞毒性颗粒释放低于αβ培养物，并且在BLN刺激下未发生扩增。细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）与CD3衔接器治疗期间全身性细胞因子激增和广泛的T细胞活化相关；然而，本实验并非为模拟这些临床毒性而设计，且体外细胞因子水平和BLN暴露条件可能无法反映体内暴露动力学。因此，这些特征可能提示γδ基础策略具有独特的炎症特征。γδ过继转移联合BLN治疗是否能提供额外的肿瘤控制，以及它如何影响CRS/ICANS的发生率或严重程度，仍有待未来的临床前研究和临床试验进行检验。
Zole扩增方案已成为产生临床级γδ T细胞产品的标准方法。数项正在进行的临床试验正在评估Zole扩增的γδ T细胞，无论是作为单药治疗还是与BLN联合使用，以增强疗效并改善T细胞适应性，特别是在接受化疗的经重度预处理患者中。γδ T细胞在过继转移设置中的一个关键优势是其先天样、非同种异体反应性的特征，消除了与移植物抗宿主病（GvHD）相关的担忧，因此使其对异基因和现成疗法特别有吸引力。结合本文观察到的靶负荷依赖性，过继性γδ T细胞转移联合BLN最有可能在低负荷/MRD样设置和/或αβ T细胞适应性受损的患者中进行探索；这一假设需要专门的临床前测试和临床评估。此外，优化γδ T细胞扩增方案，例如联合使用细胞因子IL-2、IL-15和维生素C，已被证明可显著增强细胞毒功能和增殖，同时减少凋亡，这为未来的临床应用指明了有前景的方向。
总之，本研究结果强调了γδ T细胞在过继性T细胞治疗中的治疗潜力，特别是在用Zole体外扩增时。其在BLN刺激下稳定的细胞毒性功能、CD3表达的维持，以及无同种异体反应性，可能为设计过继性免疫治疗方案提供优势，但这有待在患者来源模型和临床研究中验证。未来的临床研究有必要评估Zole扩增的γδ T细胞产品单独使用或与BLN及其他免疫调节剂联合使用的临床疗效和长期益处，以充分利用其治疗潜力，改善CD19表达恶性肿瘤患者的预后。
