1 BACKGROUND
阿尔茨海默病（AD）是全球痴呆症的主要病因，女性在症状出现后面临更高的风险和更快的进展速度。AD在诊断前数十年即已开始，但最早的神经基质和性别差异的生物学基础仍不清楚。证据表明脑干，特别是蓝斑核（LC），是疾病的初始部位：tau病理出现的时间早于内嗅皮层，脑干萎缩可预测痴呆，早期脑干变化与睡眠障碍和抑郁等前驱症状相关。这些发现表明脑干病理出现在无症状个体中，并可能受性别调节。星形胶质细胞与神经元一样具有异质性，并经历影响韧性或脆弱性的状态转换。作者提出LC中的不适流星形胶质细胞转换有助于早期性别相关的易感性。
星形胶质细胞协调突触支持、代谢耦合和神经免疫信号传导。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞骨架重塑的典型标志物。血浆GFAP水平在整个AD连续谱中升高，尽管中枢与外周来源的相对贡献仍有争议，并且早期非反应性星形胶质细胞状态与循环GFAP之间的关系尚不清楚。星形胶质细胞可通过多种途径促进病理：增加的α2-Na+/K+-ATPase表达驱动神经炎症和tau积累；寡聚淀粉样蛋白β（Aβ）诱导星形胶质细胞补体成分3（C3），通过神经元C3aR信号传导重塑神经元树突；以及谷氨酸处理失调促进兴奋性毒性。这些途径支持星形胶质细胞对早期AD的贡献。
LC-去甲肾上腺素（NE）系统与这些机制相交。LC变性是AD的早期特征，去甲肾上腺素能损失与认知能力下降和神经精神症状相关。去甲肾上腺素能张力发挥阶段依赖性效应：在衰老和临床前AD中，较高的中枢NE与较好的记忆力相关，而在症状阶段，升高的NE与神经精神负担相关。LC-NE也编程星形胶质细胞生物学，诱导转录变化，促进糖原合成，并在学习过程中实现乳酸穿梭。这些功能将LC星形胶质细胞定位为神经调节张力和局部代谢支持的调节器。
性别为LC生物学增加了一个关键层面。尽管AD在发病率、进展和生物标志物轨迹上显示出明显的性别差异，但由于有限的立体测量学效力，人类LC的解剖学性别差异仍不确定。成像测量如氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描和高场LC-磁共振成像报告了细微的性别相关信号差异。啮齿动物研究显示性别依赖的LC细胞数量，尽管这些趋势可能不适用于人类。保留的LC完整性——即使具有高Aβ负荷——与更好的认知相关。虽然性腺激素影响神经和胶质状态，但像妇女健康倡议这样的大型试验发现激素治疗会增加痴呆风险，表明其他因素驱动女性偏向的风险。抗Aβ试验中的性别特异性反应进一步强调了生物异质性。
这些空白支持了临床前AD的脑干优先、星形胶质细胞聚焦的观点，并明确关注性别。如果LC是最早受影响的部位之一，经典反应性之前的星形胶质细胞转换可能决定神经元易感性和去甲肾上腺素能平衡。在此阶段检测GFAP上调但非反应性的星形胶质细胞可能提供早期生物标志物和治疗窗口。
2 METHODS
研究使用2至3月龄APPswe/PS1dE9（APP/PS1）小鼠——一个具有寡聚Aβ但无tau病理或神经变性的阶段——结合体内脑干质子磁共振波谱（1H-MRS）与区域分辨的分子分析，包括定量实时聚合酶链反应、淀粉样蛋白β42（Aβ42）寡聚体酶联免疫吸附测定、乳酸测定、免疫组织化学、免疫印迹、星形胶质细胞分离和3D结构评估。环境 enrichment（EE）作为非药物干预。
3 RESULTS
3.1 体内1H-MRS揭示APP/PS1小鼠脑干中性别特异性星形胶质细胞相关代谢变化
脑干Aβ42寡聚体水平显示显著的性别效应，雌性APP/PS1小鼠表现出比雄性APP/PS1小鼠更高的水平。β位点APP切割酶1（BACE1）水平在雌性APP/PS1小鼠中同样升高，表明在此早期阶段存在性别偏向的淀粉样蛋白生成加工放大。
这种寡聚体负荷与体内1H-MRS检测到的几种星形胶质细胞相关代谢物的变化同时发生。谷氨酰胺（Gln）水平显示基因型的主要效应。谷胱甘肽（GSH）显示显著的性别×基因型相互作用，雌性APP/PS1小鼠表现出比雄性APP/PS1和雌性野生型（WT）更高的GSH。肌醇（mI）在雌性APP/PS1小鼠中同样升高，显示性别×基因型相互作用和性别的主要效应。牛磺酸，另一种参与渗透调节的星形胶质细胞相关代谢物，显示显著的性别×基因型相互作用，由雌性APP/PS1小鼠中升高的牛磺酸驱动。
相比之下，神经元和膜相关代谢物——总肌酸（Cr+PCr）、N-乙酰天冬氨酸（NAA）、N-乙酰天冬酰谷氨酸（NAA+NAAG）以及甘油磷酸胆碱和磷酸胆碱（GPC+PCh）——未显示显著的主要或相互作用效应，与此年龄模型中没有神经变性一致。
总之，这些发现表明，雌性早期脑干淀粉样蛋白寡聚体积累伴随着星形胶质细胞相关代谢途径中富集的代谢物变化，包括Gln、mI、GSH和牛磺酸。这些代谢物并非星形胶质细胞独有，不能排除小胶质细胞或其他细胞类型的贡献。结果强调了在此APP/PS1模型淀粉样蛋白驱动阶段的早期星形胶质细胞相关代谢和氧化变化中存在雌性偏向模式，由性别×基因型相互作用而非基因型单独驱动。
3.2 雌性APP/PS1小鼠脑桥中选择性GFAP-only星形胶质细胞激活伴随C3和NF-κB2上调
基于1H-MRS观察到的代谢物模式，接下来检查了脑桥和中脑中与星形胶质细胞、小胶质细胞和共享炎症途径相关的转录标志物。
在脑桥中，GFAP表达显示显著的性别×基因型相互作用。雌性APP/PS1小鼠表现出比雄性APP/PS1小鼠和雌性WT更高的GFAP mRNA。为了确定这是否反映了更广泛的反応性星形胶质细胞谱，评估了通常与反応性星形胶质细胞状态相关的其他标志物（波形蛋白、Serpina3n和S100a10）。均未显示显著变化，表明GFAP增加不对应于完整的反応性转录程序，可能代表早期或选择性星形胶质细胞转换。
接下来评估了星形胶质细胞相关炎症标志物（诱导型一氧化氮合酶、转化生长因子β），两者在组间无差异。小胶质细胞相关标志物（CD68、CX3CR1、C1q）以及通常在小胶质细胞激活期间上调的细胞因子（肿瘤坏死因子α、白介素[IL]-1β）也未显示显著的性别或基因型效应。类似地，星形胶质细胞和小胶质细胞均表达的转录本（核因子κB [NF-κB1]、Cox-2、IL-6）未改变。总之，这些发现表明在此早期阶段脑桥中没有广泛小胶质细胞激活或泛反応性星形胶质细胞增生的证据。
相比之下，C3——一种在炎症状态期间可由星形胶质细胞表达的补体成分——显示显著的性别×基因型相互作用。雌性APP/PS1小鼠显示比雌性WT更高的C3表达，与雄性APP/PS1小鼠相比有升高趋势。NF-κB2表达在雌性APP/PS1小鼠脑桥中也显著升高，具有性别和基因型的独立贡献。
如先前报道，脑源性神经营养因子（BDNF）表达在WT小鼠中表现出性别二态性。一致地，BDNF显示显著的性别主要效应，雌性水平较低；基因型和性别×基因型交互作用不显著。因此，APP/PS1状态未改变BDNF表达的潜在性别依赖模式。
在中脑中未检测到星形胶质细胞相关、小胶质细胞相关或共享炎症标志物的显著变化。总体而言，这些数据将雌性APP/PS1小鼠的脑桥确定为选择性转录上调GFAP、C3和NF-κB2的部位，而没有小胶质细胞激活或泛反応性星形胶质细胞签名。
为了检查星形胶质细胞是否可能有助于升高的C3信号，进行了基于ACSA-1的MACS分离星形胶质细胞富集和星形胶质细胞耗竭部分来自汇集的脑桥组织。富集质量通过富集部分中更高的GFAP和更低的CD68表达相对于耗竭部分验证。由于每个基因型池产生单个富集和单个耗竭样本，这些数据未进行统计比较以推断组间差异。在此定性数据集中，雌性APP/PS1小鼠的星形胶质细胞富集部分中C3水平似乎更高；然而，这仅解释为确认星形胶质细胞富集程序捕获了C3表达细胞，并且未从这些汇集样本中得出生物学结论。基因型效应的解释仅依赖于批量qPCR数据。
3.3 雌性APP/PS1小鼠脑桥中性别依赖性星形胶质细胞乳酸-氧化磷酸化耦合
由于脑桥中的MRS和qPCR分析均指向雌性APP/PS1小鼠中选择性星形胶质细胞相关转换，接下来检查了这些分子变化是否伴随着局部代谢环境的改变。
脑桥组织乳酸水平显示显著的基因型主要效应，雌性APP/PS1小鼠与雌性WT对照相比水平更高。神经元乳酸转运蛋白单羧酸转运蛋白2（MCT2）的表达也显示显著的性别×基因型相互作用，雌性APP/PS1小鼠表现出比雄性APP/PS1和雌性WT更高的MCT2水平。
为了评估潜在的下游能量后果，检查了氧化磷酸化（OXPHOS）组分。Ndufs8（复合物I）表达显示性别和基因型的显著主要效应，以及性别×基因型交互作用。Atp5a1（复合物V）表现出类似模式。其他OXPHOS基因（Sdhb、Uqcrc1和Cox5b）未显示显著的主要或交互作用效应。
总之，这些发现表明雌性APP/PS1小鼠在脑桥中表现出乳酸、MCT2和选择性OXPHOS组分的协调增加。虽然乳酸在此区域的细胞来源无法从这些实验中确定，但这些测量反映了淀粉样蛋白暴露背景下乳酸、MCT2和OXPHOS相关转录本的性别依赖性差异，而没有证据表明跨线粒体复合物存在统一变化。
3.4 环境 enrichment逆转雌性APP/PS1小鼠脑桥星形胶质细胞、炎症和OXPHOS相关转录本差异
为了探索雌性APP/PS1小鼠中观察到的分子改变是否可以通过经验依赖性因素修改，实施了增加感觉、认知和身体刺激的环境 enrichment（EE）范式。
EE减弱了标准饲养下观察到的GFAP、C3、NF-κB2、MCT2、Ndufs8和Atp5a1升高，表达水平不再与WT对照不同。然而，BDNF表达保留了与标准饲养中相同的性别依赖模式，表明EE未修改此测量。IL-1β在基线时未显示显著的基因型或性别依赖性差异，EE同样未改变其表达。
总之，这些结果表明EE广泛规范化了雌性APP/PS1小鼠脑桥中几种星形胶质细胞相关、炎症和线粒体基因表达变化。总体而言，数据表明EE可以减轻与早期APP/PS1病理相关的多个脑桥分子改变，以性别包容的方式，不暗示特定的细胞机制。
3.5 雌性APP/PS1小鼠LC选择性GFAP上调而无反応性胶质增生的证据
接下来评估了2至3月龄雌性APP/PS1小鼠中脑和脑桥神经调节核中的区域特异性GFAP表达。
在所检查的区域中，LC显示最显著的变化，具有显著的基因型主要效应。Tukey事后检验表明雌性APP/PS1小鼠与雌性WT对照相比GFAP强度更高。Iba1水平未改变，表明LC显示选择性GFAP升高而无平行小胶质细胞变化。
相比之下，脑桥中缝核（pR）、背内侧被盖核（DMTg）、黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）中的GFAP和Iba1强度在组间无差异。红核（RN）作为非神经调节中脑对照同样显示无基因型或性别相关差异。
为了评估LC GFAP增加是否反映了星形胶质细胞数量的变化，量化了总星形胶质细胞（Sox9阳性）并额外量化了小胶质细胞（Iba1阳性）数量。两个群体在组间无差异。LC GFAP阳性星形胶质细胞的Sholl分析显示分支或整体形态无改变。这些数据表明LC中GFAP升高发生在无检测到的星形胶质细胞数量或结构变化的情况下。
鉴于LC的功能相关性，其提供广泛的去甲肾上腺素能输入到涉及觉醒、注意力和记忆的前脑区域，此区域特异性GFAP增加可能代表早期分子改变，先于更广泛的胶质增生。EE降低了雌性APP/PS1中的LC GFAP强度，得到显著的饲养×基因型交互作用支持。Tukey事后检验确认了与标准条件相比，饲养在EE中的雌性APP/PS1小鼠GFAP水平降低，表明此早期GFAP升高对环境调节敏感。
3.6 2至3月龄APP/PS1小鼠LC NE相关标志物的性别分化调节
接下来检查了与NE处理相关的LC标志物，以确定在此早期阶段是否存在性别依赖性差异。
在LC体树突区域，NE转运蛋白（NET）免疫反应性显示显著的基因型主要效应。Tukey事后检验表明雄性APP/PS1小鼠与雄性WT相比NET水平降低，而雌性APP/PS1和雌性WT小鼠之间的差异不显著。
酪氨酸羟化酶（TH）免疫强度显示显著的性别主要效应，雌性APP/PS1小鼠显示比雄性APP/PS1更高的LC TH强度。LC胞体体积在组间无差异。在EE下，NET和TH水平不再与WT值不同。
LC中的总α2A肾上腺素能受体（α2AR）蛋白水平无性别或基因型差异。然而，当特异性在GFAP阳性星形胶质细胞中量化α2AR时，在LC胞体、树突区域和体树突区域出现显著的性别×基因型交互作用效应。Tukey事后检验显示与雄性WT相比雄性APP/PS1小鼠中星形胶质细胞α2AR信号增加，与雌性WT相比雌性APP/PS1小鼠中星形胶质细胞α2AR信号减少，反映了跨性别的相反方向性。
EE未改变总α2AR水平。EE下的星形胶质细胞分辨率α2AR测量不再显示性别或基因型依赖性差异。然而，在树突LC区域，雌性APP/PS1小鼠在EE后表现出比标准饲养更高的星形胶质细胞α2AR，而在胞体或体树突区域未发现显著的EE相关变化。
4 DISCUSSION
本研究描绘了2至3月龄APP/PS1小鼠脑干中早期、LC为中心的星形胶质细胞状态，效应在雌性中最显著。多条证据表明此状态不同于经典反応性星形胶质细胞增生或小胶质细胞激活，而是代表与性别分化去甲肾上腺素能模式一致的原初星形胶质细胞谱。通过在此框架内解析性别差异，研究结果表明雌性APP/PS1小鼠中的星形胶质细胞启动与早期淀粉样蛋白暴露期间的性别分化去甲肾上腺素能通路签名同时发生，此模式可能对后期LC易感性具有相关性。
4.1 无经典胶质增生的星形胶质细胞激活
雌性APP/PS1小鼠的脑桥显示GFAP、C3和NF-κB2增加，而无更广泛泛反応性标志物（波形蛋白、Serpina3n和S100a10）的诱导和小胶质细胞指数的变化。形态学分析进一步表明星形胶质细胞未经历肥大，总星形胶质细胞（Sox9阳性）和小胶质细胞（Iba1阳性）计数未改变。GFAP上调在解剖学上限于LC，未扩展到邻近的单胺能核，表明区域选择性星形胶质细胞转换而非全局脑干胶质增生。
雌性APP/PS1小鼠显示更高的脑干Aβ42寡聚体水平，伴随1H-MRS谱表明星形胶质细胞相关代谢途径中富集的代谢物（Gln、mI、GSH和牛磺酸）改变，而神经元完整性标志物（NAA+NAAG、GPC+PCh）未改变。脑桥还显示乳酸增加和MCT2表达升高，表明星形胶质细胞-神经元代谢耦合的转变而非明显功能障碍。这些发现最符合早期、LC限制的星形胶质细胞启动状态。
4.2 NF-κB2/补体轴和星形胶质细胞启动
雌性APP/PS1小鼠中的分子谱与脑桥星形胶质细胞内的NF-κB补体相关信号传导一致。可溶性Aβ寡聚体可触发星形胶质细胞中β1-整合素/NOX2依赖性活性氧生成和随后的NF-κB激活，与此处观察到的GFAP、C3和NF-κB2升高一致。NF-κB2升高表明非经典途径的部分参与，在星形胶质细胞炎症反应中有描述。支持此解释，MRS检测到的GSH增加，以及更高的乳酸水平、增加的MCT2表达和选择性OXPHOS相关转录本（Ndufs8、Atp5a1）的升高，反映了抗氧化相关代谢物和乳酸-OXPHOS相关基因表达的协调差异，而非跨线粒体复合物的统一变化。
尽管C3是A1型星形胶质细胞的标志，但伴随的GFAP增加发生在无额外A1标志物、星形胶质细胞肥大或小胶质细胞激活的情况下，表明早期、启动、非反応性状态而非成熟神经毒性表型。此中间谱可能有助于在低水平寡聚体应激下维持局部稳定性，同时可能降低后期激活的阈值。
4.3 星形胶质细胞优先、小胶质细胞保留序列
结果支持对可溶性Aβ寡聚体的星形胶质细胞优先反应。在AppNL-G-F小鼠中，星形胶质细胞增生出现在小胶质细胞增生之前，并且仅在斑块积累后变得显著，并且寡聚体Aβ即使在没有神经元的系统中也能直接激活星形胶质细胞。单细胞图谱识别在早期Aβ暴露期间先于或主导小胶质细胞签名的星形胶质细胞程序。人类脑脊液和脑组织同样显示早期补体激活，并且1H-MRS标志物如升高的mI，伴随Gln和GSH变化，映射到前驱队列中的星形胶质细胞重塑。与此框架一致，ACSA-1富集的星形胶质细胞部分显示更高的C3水平，表明富集方案捕获C3表达细胞；然而，由于样本汇集，星形胶质细胞贡献的程度无法确定。总体而言，这些数据指向寡聚体相关、星形胶质细胞相关的分子变化。
4.4 LC相关分子差异和性别偏向模式
LC是AD中tau病理的最早部位之一，但APP/PS1小鼠缺乏tau聚集体，并在3个月时显示完整的LC神经元；因此此处观察到的变化是淀粉样蛋白驱动的。雌性LC中选择性GFAP升高，伴随保留的神经元完整性，表明早期星形胶质细胞状态。人类成像和行为研究类似地将早期淀粉样蛋白背景下保留的LC相关生化措施和短期认知表现联系起来。此模式可能反映早期、性别相关的星形胶质细胞状态，与LC易感性具有潜在相关性。
4.5 LC优先易感性和潜在调节点
最近易感LC和相对韧性SN之间的转录组比较提供了更广泛的背景。LC神经元表现出更高的低密度脂蛋白受体（LDLR）/跨膜蛋白97（TMEM97）和更低的正弦调节轻链互作蛋白/增加的LDL受体蛋白降解，表明脂质-载脂蛋白E（apoE）相关途径的差异可能影响Aβ寡聚体处理。SN中抗氧化剂/金属硫蛋白途径的富集可能更有效地缓冲应激。尸检和小鼠研究确认Aβ寡聚体在LC神经元中积累，损害GABA/甘氨酸受体功能并增加兴奋性。在此框架内，此处识别的LC邻近星形胶质细胞谱——GFAP升高而无经典反应性——可能代表与局部易感性具有潜在相关性的早期分子状态，尽管其机制意义仍是假设性的。文献提出调节apoE–LDLR/TMEM97途径或支持抗氧化能力可能代表干预点，但这些与当前发现的关系需要进一步研究。
4.6 早期LC GFAP变化相对于血浆标志物
血浆GFAP是AD的敏感生物标志物，但通常仅在星形胶质细胞变得反応性和细胞骨架完整性受损时增加。在本研究中，在2至3个月时观察到LC GFAP的适度、前反応性增加，此阶段先于此模型中明显的胶质增生。尽管不能假设与人类生物标志物轨迹直接对应，但这些发现提出了假设，即LC局部星形胶质细胞变化可能发生在可检测的血浆GFAP改变之前。确定此类早期LC信号是否真正先于或预测外周生物标志物变化将需要纵向和跨物种研究，但当前数据表明星形胶质细胞反应序列中较早的潜在细胞事件。
4.7 EE和NE张力恢复
已知EE增强中枢去甲肾上腺素能信号传导并减轻几种AD模型中的淀粉样蛋白相关胶质激活，包括通过β-肾上腺素能途径介导的效应。在本研究中，EE类似地减少了LC为中心的星形胶质细胞启动，规范化雌性APP/PS1小鼠中的GFAP、C3、NF-κB2和MCT2−OXPHOS相关转录本。这些变化与NE相关蛋白签名正常化的转变一致，并降低LC微环境中的炎症负荷。值得注意的是，EE未改变BDNF水平，表明其在此早期阶段的效应主要通过调节星形胶质细胞-NE耦合而非神经营养途径发挥作用。
4.8 性别分化LC去甲肾上腺素能调节
研究发现确定了在此淀粉样蛋白驱动模型中早期、性别分化的LC去甲肾上腺素能调节转变。在雄性中，降低的NET连同升高的星形胶质细胞α2AR类似于先前与延长细胞外NE和更强Gi/o介导的星形胶质细胞抑制相关的配置——被认为稳定局部兴奋性和缓和炎症信号传导的条件。在雌性中，增加的TH连同降低的星形胶质细胞α2AR形成对比的受体谱，与在可比上下文中较弱NE依赖性调节反馈的报告一致。此类α2AR降低可能使雌性星形胶质细胞对NE反应性降低，可能削弱对局部炎症信号传导的抑制控制——一个与雌性中观察到的更强星形胶质细胞启动一致的假设。在早期Aβ暴露下——显示在先前工作中提高LC兴奋性——这些性别分化受体模式可能有助于解释差异性LC易感性。
EE整体恢复了NET和α2AR表达，表明这些早期去甲肾上腺素能-星形胶质细胞相互作用保持可塑性。在雌性APP/PS1小鼠中，EE增加星形胶质细胞α2AR高于基线，表明加强的NE-星形胶质细胞抑制耦合而非简单拯救。这些效应平行于先前工作显示增加NE张力可以抑制淀粉样蛋白模型中的胶质激活。人类研究类似地报告早期LC改变——升高LC对比度、NE失调和分子应激签名——在结构变性之前。此处识别的性别偏向星形胶质细胞和去甲肾上腺素能模式与这些早期阶段观察一致，同时受APP/PS1模型仅淀粉样蛋白性质的约束。
4.9 NF-κB–BACE1轴和淀粉样蛋白生成驱动
NF-κB–BACE1轴在其他模型中已被描述为连接炎症信号传导与淀粉样蛋白生成过程。雌性APP/PS1小鼠中增加的BACE1表达与这些报告一致，但此轴在本研究中的机制相关性仍是假设性的。
4.10 转化相关性和性别特异性生物标志物
人类数据日益显示星形胶质细胞相关生物标志物中的性别依赖模式，GFAP、几丁质酶-3样蛋白1和sTREM2在AD风险未受损成人中与淀粉样蛋白/tau和萎缩显示更强关联。血浆GFAP轨迹也因性别而异，女性显示更高水平和与神经变性的更强联系，并且成像研究表明GFAP可能不同地索引跨性别的微结构易感性。尽管未直接测量生物标志物，但雌性LC星形胶质细胞中适度、非反応性GFAP增加提出了可能性，即早期性别偏向星形胶质细胞状态可能 underlie 后期生物标志物轨迹的分歧。这仍是推测性的，但强调了性别意识解释的重要性。
4.11 局限性
2至3月龄的APP/PS1小鼠缺乏tau病理和神经变性，反映不同于老年或携带tau大脑中星形胶质细胞谱的淀粉样蛋白驱动状态。作为家族性、仅淀粉样蛋白模型，它也未能捕获散发性AD的异质性——包括淀粉样蛋白、tau、衰老和系统影响之间的相互作用。方法学约束——包括跨越多个核的MRS体素、NET和α2AR的免疫组织化学而非功能评估，以及EE的多因素性质——限制机制推断。最后，横截面设计阻止了时间排序或因果关系的解析。
