贾新林|王宝娟|余朝红|史晓峰|陈晓鹏|崔文国|熊焕明|毛远青
上海交通大学医学院附属上海第九人民医院骨科，骨科植入物重点实验室，中国上海市志召路639号，200011
摘要
细胞内的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在巨噬细胞内持续存在，会导致免疫麻痹，从而引发反复感染。这种持续存在主要源于其代谢休眠状态，降低了对抗微生物药物的敏感性，以及其引发氧化应激介导的巨噬细胞损伤的能力。在本研究中，通过水热碳化和聚缩合反应合成了水溶性叶酸碳点（FACDs），这些碳点通过表面官能团与Cu2+和Co2+形成稳定的双金属复合物，从而产生可降解的纳米点，能够靶向并有效抑制巨噬细胞内的MRSA。首先，FACDs的蝶呤结构使其能够特异性结合巨噬细胞上的叶酸受体，促进细胞内化。其次，Cu2+通过干扰氨基酸和能量代谢，破坏MRSA的低代谢状态，诱导类似铜死亡（cuproptosis）的杀菌效应，清除细胞内的细菌。同时，Co2+减轻巨噬细胞内的氧化应激损伤，恢复并激活其吞噬和杀菌功能。此外，利用体外巨噬细胞内细菌模型和体内MRSA生物发光成像技术，展示了这些碳点的动态抗菌过程。总体而言，本研究提出了一种创新策略，通过水溶性双金属FACDs实现巨噬细胞靶向递送、类似铜死亡的杀菌活性以及免疫功能恢复，为根除细胞内MRSA提供了综合方法。
引言
在宿主免疫防御中，巨噬细胞通过模式识别受体（PRRs），特别是Toll样受体（TLRs）识别多种微生物，从而启动免疫激活、吞噬作用和细菌清除[1]，[2]。然而，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）可以利用巨噬细胞作为“特洛伊木马”来破坏这种防御[3]，[4]。一旦进入巨噬细胞，MRSA会进入低代谢休眠状态，逃避免疫系统的清除并持续存在于细胞内[5]，[6]。此外，传统抗生素在这种情况下效果不佳，因为它们难以穿透细胞膜，在细胞内积累不足，且MRSA的耐药性不断增加，进一步增强了细菌的耐受性[7]，[8]。此外，细胞内MRSA的代谢休眠状态降低了抗生素的敏感性，使得抗生素无法有效消除细胞内的细菌，最终导致慢性及反复感染[9]，[10]。因此，提高巨噬细胞靶向的抗菌效果并打破细菌的休眠状态对于根除持续存在的细胞内MRSA感染至关重要。
研究表明，当细菌成功侵入并驻留在巨噬细胞内时，这些巨噬细胞会成为病原体的庇护所，使其免受抗生素和免疫防御的攻击[11]。细胞内的细菌会损害巨噬细胞的功能，包括吞噬作用、产生杀菌分子（如一氧化氮）和抗原呈递，从而降低细菌清除能力并促进感染复发。因此，针对巨噬细胞以恢复其免疫功能对于消除细胞内细菌至关重要。此外，细胞内细菌的低代谢休眠状态也是感染持续存在的重要原因。大多数抗生素依赖细菌的活跃代谢，但细胞内细菌会降低代谢活性——减少能量消耗并减缓DNA复制——降低抗生素的敏感性，并干扰巨噬细胞介导的免疫识别和杀灭作用[12]。因此，打破或重新激活细菌的休眠状态对于有效清除细菌至关重要。持续的细胞内感染还会导致巨噬细胞内活性氧（ROS）过度积累，引起氧化应激，损害细胞，抑制Toll样受体（TLR）信号传导，并抑制关键的杀菌转录因子（如NF-κB）[13]。这种氧化负担进一步削弱了吞噬作用、杀菌能力和抗原呈递，最终导致巨噬细胞免疫麻痹，成为细胞内病原体的滋生地，促进细菌的持续存在和细胞间传播[14]。此外，细菌还通过能量代谢调节[15]、群体感应[16]、双组分系统[17]和毒力因子表达[18]来适应环境变化，这使得打破其休眠状态变得困难。有效的清除不仅需要“唤醒”休眠细菌，还需要确保足够的抗生素浓度来立即消灭它们，同时保护巨噬细胞并减轻氧化应激，以恢复免疫功能[19]，[20]。总之，针对并打破细菌的休眠状态，结合减轻氧化应激引起的巨噬细胞免疫麻痹以及恢复巨噬细胞功能，对于根除细胞内MRSA至关重要，为治疗细胞内细菌感染提供了有前景的策略[21]。
纳米材料已成为抗生素的潜在替代品，大多数研究集中在细胞外抗菌活性或生物膜清除上——例如，通过声动力疗法或利用光热或催化效应的纳米材料[22]，[23]。然而，尽管经过多次治疗，这些方法往往无法消除细胞内的MRSA，因为它们主要针对活跃生长的细胞外细菌或生物膜，缺乏对巨噬细胞的特异性，无法使细菌在休眠、低代谢状态下被激活和杀死。此外，这些方法无法解决感染巨噬细胞内的高ROS水平或减轻氧化应激，导致吞噬和免疫功能受损，从而使细菌持续存在并扩散。碳点（CDs）是一类具有优异生物相容性和独特生物功能的碳基纳米材料[24]，[25]，在抗菌和感染治疗中显示出 promising 的优势[26]，[27]。然而，从生物活性前体（如槲皮素和褪黑素）衍生的CDs[28]，[29]虽然保留了内在的分子功能并表现出强大的抗菌活性，但缺乏巨噬细胞靶向能力，因此无法选择性作用于巨噬细胞或细胞内细菌[30]，[31]。此外，它们的亲脂性限制了溶解度和生物利用度[32]，需要增加给药频率和剂量[33]，[34]，这可能进一步引发生物安全问题。虽然CDs可以通过多种机制杀死细菌，包括膜破坏和细胞质泄漏，但在精确控制其大小和结构、提高生物相容性以及整合多功能性以减轻巨噬细胞氧化应激和恢复免疫麻痹方面仍存在挑战[35]，[36]。因此，开发能够选择性靶向细胞内细菌、打破其低代谢休眠状态同时恢复巨噬细胞免疫功能的CDs仍然是应对细胞内感染的关键挑战。值得注意的是，金属离子越来越多地被用于通过掺杂策略增强材料的生物活性，因为它们具有独特的生物效应。具体来说，铜离子（Cu2+可以与细胞内细菌酶结合，干扰复制和转录，最终引发细菌的铜死亡[37]，[38]，[39]，[40]。此外，钴（Co2+作为一种关键微量元素，表现出卓越的抗氧化活性，能够减轻细胞氧化应激，从而促进组织再生和修复[22]，[41]，[42]，[43]，[44]。因此，通过金属掺杂对碳点进行功能化是一种有效的策略，可以同步打破细菌休眠状态并恢复巨噬细胞介导的免疫功能，为解决细胞内感染这一难题提供了可行的方案。
在本研究中，我们创新性地开发了水溶性双金属叶酸碳点（CuCo-FACDs），将巨噬细胞靶向递送、类似铜死亡的杀菌活性和免疫功能恢复整合到多功能纳米点中。CuCo-FACDs表现出以下特性：（1）通过FACDs表面的蝶呤结构实现巨噬细胞靶向；（2）Cu2+干扰巨噬细胞内的MRSA氨基酸/能量代谢，破坏细菌休眠并引发类似铜死亡的杀菌效应；（3）Co2+减轻巨噬细胞内的氧化应激损伤，恢复其免疫功能，并激活吞噬和先天免疫途径（如TLR和HIF-1α），建立了一个自我维持的“杀菌免疫恢复循环”。体外实验表明，CuCo-FACDs破坏了细胞内MRSA的代谢（包括能量和氨基酸代谢途径），诱导类似铜死亡的死亡，同时破坏了细胞外的MRSA膜，导致蛋白质和核酸泄漏，从而有效消除了细胞外的MRSA并抑制了生物膜的形成。此外，CuCo-FACDs减轻了巨噬细胞的氧化应激，恢复了免疫功能，并使巨噬细胞能够有效清除细胞内的细菌。体内实验表明，CuCo-FACDs消除了植入物相关的感染并加速了MRSA感染皮肤的愈合。总体而言，这项研究证明了水溶性双金属FACDs是一种能够选择性消除巨噬细胞内MRSA的同时恢复巨噬细胞免疫功能的策略，为治疗细胞内MRSA感染提供了突破性方法。（图1）
CDs的特性
CuCo-FACDs通过水热法合成，然后与金属离子配位。透射电子显微镜（TEM）图像显示这些纳米颗粒均匀且分散良好（图1A），晶格间距为0.21 nm，对应于石墨的（100）晶面（图1B）。CuCo-FACDs的平均尺寸约为3.2 nm，尺寸分布范围为2.0至4.5 nm（图1C）。X射线衍射（XRD）图谱在2θ = 24.5°处显示出一个宽峰（图1D）
结论
在本研究中，我们开发了一种创新策略，使用水溶性双金属叶酸碳点（CuCo-FACDs）实现巨噬细胞靶向递送细胞内MRSA，诱导类似铜死亡的杀菌活性，并恢复免疫功能。体外多组学分析表明，CuCo-FACDs破坏了细菌的能量代谢，抑制了群体感应和双组分系统，并干扰了毒力因子的表达，从而打破了...
实验方法
所有实验方法均见补充数据。
作者贡献声明
贾新林：撰写——初稿、研究、数据分析。余朝红：软件、方法学、数据分析。王宝娟：撰写——审稿与编辑、研究、数据分析。史晓峰：方法学、数据分析。毛远青：撰写——审稿与编辑、资源获取、项目管理、方法学、概念构思。熊焕明：撰写——审稿与编辑、资源获取、项目管理、方法学、概念构思。崔文国：撰写——
数据可用性声明
本研究的数据可在合理请求下向相应作者获取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
X.J.和B.W.对这项工作做出了同等贡献。本研究得到了上海市卫生健康委员会（2022JC031）、上海市科学技术委员会（25ZR1401024）、上海第九人民医院跨学科基金（JYJC202301）以及国家重点研发计划（2018YFA0703000）的支持。图2A、图5A和图7A使用
biorender.com制作。图3E由
FigDraw.com制作。
