随着全球抗生素耐药性危机日益严峻，科学家们将目光投向了一种特殊的细菌“破壁工具”——噬菌体内溶素（endolysin）。这类酶能精准降解细菌细胞壁的肽聚糖（peptidoglycan），且不易引发耐药性，但绝大多数天然内溶素在高温下会迅速失活，严重限制其应用范围。在冰岛热泉中生存的嗜热菌Thermus scotoductus的噬菌体vB_Tsc2631所产生的Ts2631内溶素，却展现出惊人的耐热特性，其熔点高达99.8-104.7°C，这为开发稳定型抗菌酶提供了绝佳模板。
为揭示其热稳定机制，研究团队开展了一项残基水平的系统性研究。通过结构与序列分析发现，与嗜温同源蛋白T7溶菌酶相比，Ts2631具有更短的蛋白质环区（loop）结构和更低的B因子（表征原子振动幅度），暗示其构象灵活性更低。序列分析显示酪氨酸（Y）、脯氨酸（P）、色氨酸（W）和精氨酸（R）等与热稳定性相关的残基比例显著升高。
关键技术方法包括：通过定点突变技术构建55个Ts2631突变体，利用圆二色谱测定热熔点（Tm），结合X射线晶体学进行三维结构比对，并采用肽聚糖结合实验验证关键残基功能。所有实验菌株均分离自冰岛热泉环境样本。
催化中心残基对热稳定性的核心作用
突变催化锌离子（Zn²⁺）配位残基H30、H131和C139会导致Tm值急剧下降，证实金属离子结合网络对维持蛋白质整体构象具有基础性支撑作用。邻近催化位点的Y60和Y69突变体也出现稳定性显著降低，提示芳香族侧链通过π-π堆叠作用加固活性中心微环境。
二硫键与盐桥的稳定性贡献有限
C80-C90二硫键突变体仅引起轻微稳定性变化，精氨酸介导的盐桥（R20除外）对热稳定性影响较小，这与常规认知中二硫键作为热稳定关键因素的观点形成对比，表明Ts2631可能演化出独特的稳定性维持策略。
芳香族与脯氨酸残基的关键角色
埋藏在蛋白质内部的色氨酸突变体W102A、W109A、W145A以及脯氨酸突变体P140A均导致Tm值降低2.5-5.5°C，证明这些残基通过疏水相互作用和构象限制效应，像“分子铆钉”般稳定蛋白质三维折叠。尤其值得注意的是，位于蛋白质核心的W109虽然不参与底物结合，但其突变对稳定性影响最大，提示内部芳香族集群的形成是热稳定的关键。
界面残基的双功能特性
位于蛋白质表面的R20被证实具有双功能：其突变不仅降低热稳定性，更导致肽聚糖结合能力完全丧失。该发现为理解蛋白质演化过程中功能位点与稳定位点的协同进化提供了新视角。
本研究通过残基水平的功能图谱绘制，揭示了嗜热内溶素Ts2631的热稳定机制主要依赖于内部芳香族残基网络构成的“疏水内核”，而非传统的二硫键主导模式。这一发现颠覆了对蛋白质热稳定机制的传统认知，为理性设计高稳定性治疗性内溶素提供了新范式。特别值得注意的是，将嗜温内溶素中非关键位置的残基替换为色氨酸或脯氨酸，有望成为增强酶稳定性的普适性策略。该研究不仅为开发耐储存、广适用的新型抗菌制剂奠定了理论基础，更为蛋白质工程领域提供了重要的设计原则。论文发表于《Scientific Reports》，对推动抗生素替代疗法的开发具有里程碑价值。
