LeuO通过抑制ssrA转录精细调控鼠伤寒沙门菌SPI-2毒力岛的功能

本研究揭示了转录调节因子LeuO在鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）中作为SPI-2（Salmonella pathogenicity island-2）毒力岛新型负调控因子的关键作用。通过ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）和EMSA（电泳迁移率变动分析）等技术，作者发现LeuO通过直接结合于ssrA启动子区的特定基序（ssrA1和ssrA2）来抑制其转录，进而下调整个SPI-2基因簇的表达，最终削弱细菌在巨噬细胞内的生存能力。这项工作阐明了LeuO在沙门菌系统感染过程中精细调控毒力的新机制，为理解其全局调节网络提供了重要见解。

ABSTRACT

LeuO最初在大肠杆菌（Escherichia coli）中被鉴定为亮氨酸调节因子，随后被发现是包括沙门菌（Salmonella）、志贺菌（Shigella）和弧菌（Vibrio）在内的多种细菌致病性所必需的全局调节因子。本研究旨在确定LeuO在沙门菌毒力岛（SPI）-2中的调节作用，该岛对肠沙门菌鼠伤寒血清型（S. Typhimurium）的细胞内增殖至关重要。LeuO的过表达抑制了SPI-2基因的转录，并相应地降低了其蛋白水平。染色质免疫沉淀测序揭示了LeuO在鼠伤寒沙门菌14028中的全基因组结合位点，并鉴定出一个与先前在大肠杆菌中发现的基序高度相似的独特23核苷酸基序。值得注意的是，在SPI-2内预测了多个LeuO结合位点，主要位于ssrA和ssrB基因座附近。体外结合实验验证了LeuO与位于ssrA附近（相对于其转录起始位点）-35至-12（ssrA₁）和+231至+254（ssrA₂）位点，以及ssrB附近-622至-599（ssrB₃）位点的三个特定基序之间的高结合亲和力。此外，LeuO的过表达完全消除了与含有ssrA₁和ssrA₂的ssrA启动子融合的lacZ的转录，表明LeuO通过直接结合抑制ssrA。LeuO的缺失增加了鼠伤寒沙门菌在巨噬细胞内的存活率，而其过表达则减弱了细菌的复制，这推测与LeuO对SPI-2的下调有关。本研究揭示了LeuO的多功能调节机制，并强调了其在调节SPI-2表达中的关键作用，从而为理解沙门菌在系统感染过程中毒力的精细调控提供了关键见解。

1. 引言

LeuO是LysR型转录调节因子（LTTRs）家族的成员，该家族是原核生物中最大的转录调节因子家族之一。LTTRs在控制与多种细胞功能相关的无数基因中发挥着至关重要的作用，包括氨基酸生物合成、芳香族化合物降解、抗生素耐药性、氧化应激反应、固氮、群体感应和毒力。LTTRs具有相似的大小，介于300至350个氨基酸之间，通常包含一个具有翼状螺旋-转角-螺旋基序的N端DNA结合结构域、一个 enable 二聚化的长连接螺旋和一个C端效应子结合或调节结构域。LTTRs执行双重功能：靶启动子的转录激活和抑制。在与效应子分子或共诱导物相互作用后，它们主要作为转录激活剂，靶向特定的AT-rich DNA序列。然而，大多数LTTRs无论是否存在共诱导物，都会结合其靶启动子，有些则作为阻遏蛋白发挥作用，以负自身调节为代表。

先前对沙门菌LeuO的功能研究是该领域的一个显著里程碑。该研究在肠沙门菌肠亚种鼠伤寒血清型（以下简称鼠伤寒沙门菌）菌株SL1344中使用了染色质免疫沉淀（ChIP）-on-chip技术，揭示了总共178个LeuO结合位点分布在整个细菌染色体上。这些位点出现在核心和水平获得性遗传区域，并包含与基本功能和毒力相关的基因。值得注意的是，其中68个结合位点与全局阻遏蛋白H-NS的结合位点重叠，表明存在潜在的相互作用；然而，LeuO可能不会置换H-NS。此外，RNA聚合酶结合同时发生在173个这些LeuO结合位点，突显了LeuO作为一种转录调节因子，具有两个不同的靶位点，其中H-NS共同结合或不结合。LeuO结合位点的计算分析揭示了一个与其他LysR型转录因子共有的T-N11-A基序，尽管与从大肠杆菌LeuO推导出的基序相比存在一些变异。尽管如此，许多LeuO靶基因在两个物种之间是共享的，强调了LeuO的全局调节重要性。在沙门菌中发现的一个独特机制是LeuO对沙门菌毒力岛（SPI）-1表达的调节。SPI-1是沙门菌入侵上皮细胞所必需的重要毒力决定因子。LeuO激活hilE的转录，该基因编码SPI-1的主要负调节因子，表明LeuO对SPI-1的下调是由HilE介导的，HilE抑制了SPI-1调节网络的核心调节因子HilD的活性。H-NS也通过抑制核心正调节因子如HilA和HilD的转录来抑制SPI-1的表达。因此，有人认为LeuO是在某些环境下H-NS介导的沉默受阻时，用于SPI-1下调的备用机制。

非伤寒沙门菌在感染肠道屏障的早期阶段需要SPI-1。之后，沙门菌在各种类型宿主细胞（包括巨噬细胞）中的存活主要取决于SPI-2。SPI-2基因的表达由双组分调节系统SsrAB协调，并受环境因素如pH、离子和营养物质的影响。SsrA是一种感应组氨酸激酶，响应环境信号并使SsrB磷酸化，SsrB进而结合多个SPI-2基因的启动子以激活或去抑制它们的表达。LeuO作为全局调节因子的多方面作用促使我们探索其在SPI-2基因表达中的潜在调节作用。我们利用染色质免疫沉淀 followed by sequencing (ChIP-seq) 来识别LeuO的全基因组结合靶点，假设LeuO通过结合多个SPI位点（包括SPI-2）来调节沙门菌的毒力。该研究旨在揭示一个新的转录调节层面，并为了解LeuO作为关键参与者精细调节沙门菌毒力的复杂调节网络提供见解。

2. 材料与方法

2.1. 细菌菌株

本研究使用的细菌菌株列于表S1。鼠伤寒沙门菌菌株14028（ATCC 14028）作为本研究的亲本菌株。使用λ Red重组系统构建了缺失leuO的突变菌株。使用Red-leuO-F/R引物（表S2）通过聚合酶链反应（PCR）扩增pKD13的卡那霉素抗性基因（kan）盒。引物在每个末端包含一个40核苷酸的同源序列，该序列与靶位点同源，并使PCR产物能够通过同源重组替换靶基因。随后，将含有kan盒的PCR产物导入含有pKD46的受体细胞。随后通过flippase介导的重组切除抗生素标记，导致非极性和框内缺失。产生HA标签蛋白（如SseA-HA、SscA-HA和SseD-HA）的沙门菌菌株在先前的研究中构建。

2.2. 质粒构建

本研究使用的所有质粒列于表S1。为了构建质粒pWSK129-LeuO，通过PCR扩增leuO编码序列及其推定的启动子区域，并使用SalI和BamHI限制性位点克隆到pWSK129中。为了构建质粒pBbA2sk-LeuO和pASK-IBA33plus-LeuO-3×Flag，其中leuO在P_tet启动子控制下表达，将leuO编码序列分别克隆到用BglII/BamHI消化的pBbA2sk-RFP和用BsaI/AvrII消化的pASK-IBA33plus-3×Flag中。类似地，为了构建pET21-LeuO-6×His，将leuO编码区克隆到pET21a(+)的NheI和HindIII限制性位点。

为了构建ssrA和ssrB的转录lacZ融合，分别使用引物pRS415-P_ssrA::lacZ-CF/CR和pRS415-P_ssrB::lacZ-CF/CR扩增ssrA（-249至+348）和ssrB（-695至+304）的启动子区域，并克隆到pRS415中。这些引物设计为在扩增产物的5'末端引入EcoRI突出端，在3'末端引入平末端。用BamHI处理质粒pRS415，随后用Klenow片段处理产生平末端，然后用EcoRI消化进行连接。为了构建P_ssrAM1/2::lacZ、P_ssrA1/M2::lacZ和P_ssrBM3::lacZ，合成了包含23核苷酸CG-rich序列以替代推定的LeuO结合基序的DNA片段，并如上所述克隆到pRS415中。23核苷酸CG-rich序列（5′-CCCTGGCGCGGATTGGCGGCGAC-3′）衍生自SL3361。所有限制性和重组酶均购自New England Biolabs。所有引物序列在表S2中提供。

2.3. 细菌培养条件

除非另有说明，沙门菌菌株在37°C的Luria–Bertani（LB）培养基中培养。使用以低磷酸盐和镁浓度为特征的微量培养基来模拟细胞内环境，但略有修改。简言之，将沙门菌细胞在调整至pH 7.0的微量培养基肉汤（100 mM Tris-Cl, 5 mM KCl, 7.5 mM (NH₄)₂SO₄, 0.5 mM K₂SO₄, 0.2% glycerol, 0.1% casamino acid, 10 mM KH₂PO₄, and 10 mM MgCl₂）中预培养10小时，并稀释到酸化至pH 5.0的新鲜微量培养基肉汤中。需要时加入氨苄青霉素（50 μg/mL）、氯霉素（35 μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）抗生素。

2.4. ChIP assay

将含有pASK-IBA33plus-LeuO-3×Flag的沙门菌野生型菌株在LB肉汤中培养1小时，并加入1 ng/mL脱水四环素（aTc）以诱导LeuO表达。在生长对数中期，使用1%甲醛进行染色质交联20分钟，并用125 mM甘氨酸淬灭。用TE缓冲液（10 mM Tris-EDTA, pH 8.0）洗涤细菌细胞两次，并重悬于补充了蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液（10 mM HEPES-KOH at pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% sodium deoxycholate, and 0.1% SDS）中。细胞裂解孵育30分钟后，进行超声处理将DNA剪切至100 bp至1 kb的大小，随后在10,000 × g离心20分钟以澄清裂解液。对于免疫沉淀，将上清液与小鼠抗FLAG抗体或作为非特异性结合阴性对照的小鼠IgG在4°C孵育12小时。样品进一步与预洗的抗小鼠IgG dynabeads孵育6小时。使用磁架依次用每种缓冲液（即裂解缓冲液、高盐缓冲液、LiCl缓冲液和TE缓冲液）洗涤珠子结合的复合物两次。使用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, pH 8.0）从珠子上洗脱染色质，并在65°C下用0.2 M NaCl解交联过夜。在37°C用RNase A处理1小时去除残留RNA，并在55°C用Proteinase K消化蛋白质2小时。然后使用苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1, v/v）提取DNA，并储存在-80°C用于下游测序。

2.5. ChIP sequencing (ChIP-seq) and data analysis

文库制备和测序由Macrogen（韩国首尔）进行。使用TruSeq ChIP Library Preparation Kit根据制造商的指南制备全基因组文库。使用TapeStation系统和高灵敏度D5000 screen tape评估文库的大小和质量。使用NovaSeq 6000系统对正常IgG和抗FLAG抗体处理的样品进行测序，分别产生约3100万和3300万条长度为101个碱基对的paired-end reads。使用Burrows–Wheeler Aligner将原始FASTQ文件比对到鼠伤寒沙门菌14028参考基因组（登录号：CP001362.1, CP001363.1）。然后使用SAMtools对比对后的reads进行排序，并使用Picard Tools去除重复。使用MACS2进行peak calling，默认参数设置为识别narrow peaks和summits。识别出的peak位置用于后续的motif发现分析。使用QIAGEN CLC Genomics Workbench可视化ChIP-seq比对数据。ChIP-seq数据已存入NCBI GEO数据库，登录号为GSE280231。

2.6. LeuO-binding motif identification and in silico LeuO-binding prediction

使用从MACS2获得的、q值 cutoff < 0.01的peak summit数据来推导LeuO结合基序。使用bedtools收集跨越peak位置±50个碱基对的核苷酸序列，以鼠伤寒沙门菌14028基因组作为参考。使用MEME套件在经典模式下使用默认参数设置对这些summit序列进行比对和分析以进行motif发现。使用软件工具Find Individual Motif Occurrences (FIMO) 扫描整个基因组中的预测基序，所有参数设置为其默认值，并使用Circa创建圆形图像。使用FIMO的全基因组LeuO结合谱的完整列表在表S6中提供。使用MAST工具在SPI-2区域及其相关的SPI-2外效应子序列中搜索LeuO结合基序：使用的SPI-2簇为Chr1:1,485,929 to Chr1:1,511,581（GenBank ID: CP001363.1），以及通过SPI-2编码的III型分泌系统（T3SS）转运的效应子序列，位于每个起始密码子上游500 bp和下游200 bp。除处理反向互补链的选项调整为‘treat as separate strand’以考虑链方向外，保留默认选项。

2.7. Reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR)

用RNAprotect Bacterial Reagent处理细菌细胞以防止RNA降解，并使用RNeasy Mini Kit提取RNA。使用Turbo DNA-free Kit去除DNA，并使用cDNA EcoDry^TMPremix合成cDNA。使用Thunderbird^TMSYBR^TMqPCR Mix和StepOnePlus Real-Time PCR系统进行RT-qPCR。使用Primer Express Software设计RT-qPCR中使用的引物，并列于表S3。为确保准确定量，使用gyrB作为参考基因对靶基因的mRNA表达水平进行归一化，并以ΔC_T表示。

2.8. Immunoblot analysis

将细菌细胞沉淀并在1× Laemmli缓冲液中煮沸10分钟。收集细菌培养上清液并进行三氯乙酸沉淀以浓缩分泌蛋白。将细胞裂解物和分泌蛋白（均重悬于Laemmli缓冲液中）用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，随后用针对FLAG标签或HA标签的单克隆一抗进行探测。作为比较SDS-PAGE凝胶泳道间细菌细胞的对照，使用抗DnaK抗体评估DnaK水平。使用HRP偶联的山羊抗小鼠IgG二抗检测一抗。使用Amersham™ ECL Prime Western Blotting detection reagent显示印迹信号，并使用ChemiDOC™ MP System分析化学发光信号。

2.9. Purification of LeuO-6×His

将含有pET21-LeuO-6×His的大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS在LB肉汤中培养至生长对数中期，随后在25°C用0.1 mM IPTG处理5小时。在10,000 × g离心10分钟收获细菌细胞，并在含有5 mg/mL溶菌酶的裂解缓冲液（50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0）中孵育20分钟。通过超声处理破坏细菌细胞，并在10,000 × g离心10分钟。将分离的上清液与Ni-NTA agarose混合，并在4°C轻轻搅拌过夜。用洗涤缓冲液（50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0）洗涤树脂三次，并使用1 mL洗脱缓冲液（50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole, pH 8.0）洗脱LeuO-6×His。随后通过在4°C在储存缓冲液（30 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 20% glycerol, 5 mM DTT, and 3 mM EDTA）中透析过夜去除咪唑。使用Bradford assay定量蛋白质含量。

2.10. Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA)

分别使用引物P_ssrAEMSA-F/R和P_ssrBEMSA-F/R（表S4）扩增包含ssrA_1,2（-249至+348）和ssrB_3,4（-695至+304）的启动子区域。合成了缺乏LeuO结合基序的DNA片段。将20 nM的DNA模板与不同浓度的LeuO-6×His在20 μL 1×结合缓冲液（2 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 0.2 mM MgCl₂, 2% glycerol, and 0.01 mM EDTA, pH 8.0）中孵育30分钟。将反应物与2 μL 10× loading dye混合，并在6%非变性凝胶上进行电泳。使用SYBR Safe DNA Gel Stain对凝胶进行染色，并在紫外光下观察。

2.11. β-galactosidase assay

使用Miller方法测定β-半乳糖苷酶的活性。简言之，在生长对数中期收获细菌细胞，在13,000 × g离心1分钟，然后重悬于1 mL Z缓冲液（60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl, and 2 mM MgSO₄, pH 7.0）中，并补充40 mM β-巯基乙醇。使用DU 730光谱仪测量600 nm的光密度（OD₆₀₀）。取50 μL等分试样与950 μL新鲜Z缓冲液、40 μL氯仿和20 μL 0.1% SDS混合，并孵育10分钟。加入0.2 mL新鲜制备的0.4%邻硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷开始酶促反应。当样品变