综述：亚油酸双加氧酶及其细胞色素P450伴侣与环氧合酶级联酶的结构与催化比较

这篇综述由权威专家撰写，系统比较了真菌亚油酸双加氧酶（DOX）及其细胞色素P450（CYP）融合伴侣与环氧合酶（COX）的结构与催化机制。文章创新性地运用AlphaFold2（AF2）预测模型，揭示了这些酶在底物识别位点（SRS）和α螺旋折叠上的进化保守性，并深入探讨了氢过氧化物均裂与异裂的催化抉择机制。通过对8R-DOX、9S-DOX、10R-DOX等关键酶的结构功能分析，为理解氧脂素生物合成及真菌致病性提供了新的结构生物学见解，对开发新型抗炎药物及抗真菌策略具有重要指导价值。

1. 引言

二十烷酸类和十八烷酸类统称为氧脂素，是由人类及低等生物中的不饱和脂肪酸氧化形成。在人体中，源自花生四烯酸（AA）的二十烷酸类在疼痛、炎症、哮喘、心血管疾病和生殖过程中扮演关键角色。而植物和真菌则产生源自油酸（OA）、亚油酸（LA）或α-亚麻酸（ALA）的十八烷酸类，参与繁殖、发育及宿主-病原体相互作用。这些不饱和脂肪酸通过两类金属双加氧酶家族启动氧化过程。

2. 环氧合酶（COX）与双加氧酶（DOX）的三维结构与AF2模型

2.1. COX的三维结构与AF2模型

对卵清COX-1（ovCOX-1）、小鼠COX-2（muCOX-2）和人COX-2（huCOX-2）的三维结构与其AF2模型的比较显示，两者Cα原子叠合均方根偏差（rmsd）在0.23-0.48 Å之间，表明AF2模型具有极高的预测精度。COX的催化结构域包含17个α螺旋（标记为α1至α17）。AF2模型能很好地解析这些保守的α螺旋结构。

2.2. DOX的AF2模型概述

真菌来源的DOX（如8^R-DOX-AOS）的AF2模型平均pLDDT置信度很高（>90）。其催化结构域（DOX和CYP）的预测非常准确，尽管膜结合域（MBD）和某些环区（如αG´）的预测置信度稍低。与原核生物10^S-DOX（仅542个氨基酸）相比，真菌DOX的序列更长（1050-1170个氨基酸），主要差异在于MBD的长度。超级定位分析表明，10^S-DOX与COX-1的催化结构域从αB到α17的α螺旋结构是保守的（rmsd约1.2 Å），提示它们可能起源于一个古老的过氧化物酶前体。

2.3. 亚油酸二醇合酶（LDS）的AF2模型

8^R-DOX-7,8-LDS和8^R-DOX-5,8-LDS是LDS家族的两个原型。其AF2模型显示，真核DOX的α螺旋与COX的催化结构域基本对齐。而其CYP结构域（融合伴侣）的α螺旋束与P450 BM3（从αB到αL）的α螺旋在叠合中显示出保守的Cα原子折叠。8-和9-AOS以及12^R-EAS也以类似方式对齐。

2.4. DOX与COX的α螺旋结构

8^R-DOX的α螺旋与ovCOX-1从α2到最后一个α17的螺旋在超级定位中对齐。COX-1含有三个（α7, α8, α9）在8^R-DOX中没有明显同源物的α螺旋，而8^R-DOX本身也含有三个独特的α螺旋。第三个独特的α螺旋（P628-L638）位于α17之后，是酶表达所必需的。8^R-DOX的α螺旋结构在8^S-、9^R/9^S-和10^R-DOX中基本保留。

2.5. 9-和8-DOX的底物识别位点（SRS）

在ovCOX-1:LA复合物中，LA以羧基朝外（carboxylate-out）的取向弯曲（"L"形）在底物空腔中。9^S-DOX的底物空腔弯曲度较小，其催化Tyr433在超级定位中靠近COX-1:LA复合物中LA的C11。9^R-DOX的底物空腔入口预测在蛋白质表面，其催化Tyr431的位置与9^S-DOX的Tyr433完全相同。8^R-DOX的底物空腔由两个由相对狭窄通道连接的腔室组成，其催化Tyr374在超级定位中靠近LA的C11。

3. 9^R-和9^S-DOX及其AF2模型

3.1. 9-DOX和ovCOX-1对脂肪酸的氧化

9^S-DOX和ovCOX-1分别通过夺取LA的11^R和11^S氢来氧化LA，随后O₂在C9插入，分别产生9^S-HPODE和9^R-HPODE。9^R-DOX也夺取11^R氢，但催化顺式（suprafacial）氢夺取和O₂插入，类似于8^S-DOX。

4. 8^R-、8^S-和10^R-DOX及其AF2模型

4.1. 8-DOX对脂肪酸的氧化

8^R-和8^S-DOX夺取LA的C8上的8^S氢，但在不同的立体位置插入O₂。8^R-DOX-7,8-LDS和8^R-DOX-AOS主要氧化LA-甘氨酸结合物于C8，也在C9有氧化。而LA的异亮氨酸和色氨酸结合物则通过夺取C11氢并在C9和C13插入O₂被氧化。

4.2. 8^R-DOX与COX的SRS比较

8^R-DOX的SRS部分关键残基与COX同源。远端血红素配体（H203Q）和中央Tyr残基（Y329F）的替换仅降低催化活性，但Tyr329Leu、Tyr376Phe、Trp378Phe和Tyr531Phe的替换则完全废除了催化作用。SRS中一个孤立位置的保守Lys540（替换为L, Q, R）也废除了催化作用。

4.3. 烯丙位点的动力学氘同位素效应

COX-1、8^R-DOX和9^S-DOX氧化氘代LA的动力学氘同位素效应均小于5，表明在双烯丙位（bisallylic）的氢提取能垒较低。而在烯丙位（allylic）的氢提取能垒要高得多，这通过8^R-DOX氧化氘代OA和COX-1氧化氘代20:1n-6时观察到的大同位素效应（>20）得以证明，这可能涉及氢隧道效应。

4.4. 10^R-DOX对脂肪酸的氧化

10^R-DOX将LA氧化为10^R-HPODE。10^R-DOX-1在C10氧化OA，而10^R-DOX-2主要在C8氧化OA。10^R-DOX-2也氧化20:2n-6和20:3n-3于C10和C12。

4.5. 8-和10-DOX的SRS与氧插入

8^R-和8^S-DOX的SRS在中央和末端基序上高度保守。10^R-DOX-1的SRS与8^R-DOX在少数几个位置不同。对10^R-DOX-1的L384V和V388L替换（或8^R-DOX的V330L替换）改变了在C8和C10的O₂插入偏好，表明这些位置控制着氧化位点。

5. 10^S-DOX及其AF2模型

5.1. 10^S-DOX

10^S-DOX将OA和LA氧化为10^S-氢过氧化物，但不氧化18:3n-6，对20:2n-6的氧化速率较低。推测其以羧基朝内（head-first）方式结合LA。

5.2. 10^S-DOX、COX的α螺旋与SRS

10^S-DOX与COX-1的Cα原子折叠对齐rmsd约为1.2 Å。10^S-DOX含有COX的MBD中αB-αD三个同源α螺旋。其SRS的末端基序与COX和真核DOX均不同。

5.3. 10^S-与10^R-DOX的比较

10^S-DOX和10^R-DOX-1序列同一性为21%，Cα原子折叠rmsd为1.5 Å。10^R-DOX-1的L384V和V388L替换增加了在C8的氧化，提示10^S-DOX中相应位置的Ile306和Thr310可能值得研究。

6. LDS与环氧醇合酶（EAS）概述

自给自足的催化机制在7,8-LDS和8^R-AOS这两个原型中进行了总结。一个关键问题是8^R-氢过氧化物基团的异裂和均裂切割是如何控制的。半胱氨酸结合的血红素铁两侧的残基可能促进这些反应。

7. 8^R-LDS、10^R-环氧醇合酶（EAS）及其AF2模型

7.1. 8^R-LDS

序列比对将四种8^R-LDS分为三组：植物病原体的7,8-LDS、曲霉属的5,8-LDS和青霉属的6,8-和8,11-LDS。5,8-LDS催化16:1n-7、OA、LA和ALA的8^R-氢过氧化物进行分子内羟基化，但不氧化19:3n-3的9^R-氢过氧化物。

7.2. 8^R-LDS的SRS

5,8-LDS的活性位点显示，带有FxxxF（SRS2）和NQxQ（SRS4）序列的αF和αI螺旋在超级定位中位于P450 BM3血红素辅因子的附近。对SRS2和SRS4的定点突变改变了催化。例如，两个5,8-LDS中SRS4的Asn残基（N878L和N887Q替换）将8^R-HPODE的羟基化位置部分地从C5转移到C6和C7。

7.3. 10^R-环氧醇合酶（10^R-EAS）及其SRS

10^R-EAS通过分子内环氧化将10^R-HPODE转化为环氧化物，这与8^R-LDS的分子内羟基化类似。10^R-EAS的SRS与5,8-LDS和其他8^R-LDS相比，有许多保守残基，SRS4的残基仅在少数位置不同。SRS4的Asn残基可能通过直接或水介导的氢相互作用促进氢过氧化物的异裂，但10^R-EAS的N965V替换仅降低了催化活性，表明该Asn并非必需。

8. 8-和9-AOS及其AF2模型

8.1. 8^R-和8^S-AOS及其SRS

8^R-和8^S-AOS将OA、LA和ALA的8-氢过氧化物转化为不稳定的丙二烯氧化物。它们的底物特异性不同。8^R-AOS将9^R-HPODE转化为环氧醇而非丙二烯氧化物。8^S-AOS将9^S-HPODE异构化为丙二烯氧化物和环氧醇（比例约1:2），但8^R-HPODE是较差的底物。

8.2. 9^R-和9^S-AOS及其SRS

9^S-AOS将OA、LA和ALA的9-氢过氧化物（S立体异构体）异构化为丙二烯氧化物，但不异构化相应的R立体异构体。9^R-AOS异构化OA和LA的9^R-氢过氧化物以及9^S-HPODE为丙二烯氧化物，但不异构化ALA的9^R-和20:2n-6的11^R-氢过氧化物，提示其活性位点可能太小而无法容纳后两者。

9. 与一种植物和三种人类CYP原型的比较

9.1. PGH₂19^R-羟化酶

精囊中PGH₂19^R-羟化酶的催化沟槽（SRS4含有TFmFGGhdT³³²T）含有三个排列的Thr残基，其中Thr332面向血红素铁。Thr残基可能通过向常规CYP的血红素结合双氧（Fe^IIIO₂）传递质子来促进O₂的异裂。

9.2. AOS、PGIS和TXS

真菌和植物的AOS通过HPODE的均裂形成丙二烯氧化物。植物AOS可以通过SRS4序列中的Asn321（FATcFN³²¹TwGGMKI）支持这种裂解，该残基靠近血红素铁。人PGIS的SRS4序列（LQlWATQGN²⁸⁷MgPA）中的Asn287可能通过直接或水介导的氢相互作用促进内过氧化物的均裂。而TXS的AF2模型在超级定位中显示其SRS4序列（QafIFlIAGYEI³⁴⁵ITNT）中的Ile345位于Asn287的位置，表明内过氧化物的均裂即使在没有酰胺残基的情况下也能发生。

10. 讨论

AF2模型极大地促进了对真核和原核DOX及其CYP伴侣的结构与机制理解。这些模型揭示了SRS中的关键位置，这些位置控制着氢提取、O₂插入的立体特异性以及氢过氧化物的后续异构化反应。COX、10^S-DOX和真菌LDS可能从一个古老的细菌过氧化物酶前体进化而来，其CYP融合伴侣可能源自CYP超家族的一个古老细菌祖先。对氧-氧键均裂与异裂的控制可能不仅取决于血红素铁近端的特定残基（如Asn），还受到底物在活性位点中呈现方式的立体因素影响。AF2模型为通过定点突变进行深入的机制研究提供了可靠的结构框架，有望在未来揭示更多关于这些重要酶家族的催化奥秘。