Abstract
Purpose
急性髓系白血病（AML）作为最具侵袭性的白血病类型，亟需新型治疗策略。药物重定位为加速药物开发提供了可行途径。强心苷（CGs）作为传统治疗心脏疾病的药物，在AML治疗中展现出潜力。鉴于白血病干细胞（LSCs）是AML复发和化疗耐药的关键因素，本研究旨在阐明原海葱苷原（PSN）和哇巴因（OUA）这两种具有抗LSCs活性的CGs的潜在共享机制，重点关注其多靶点效应——这一癌症治疗的新兴策略。
Methods
研究采用整合性计算机模拟框架，结合网络药理学、生物信息学和分子对接技术，以阐明分子机制、识别临床相关靶点并评估PSN和OUA的结合潜力，预测结果随后通过体外实验验证。
Results
通过将SwissTargetPrediction预测的化合物靶点与临床数据库整理的AML相关基因进行交叉分析，确定了PSN–OUA在AML中的17个共享核心靶点。利用基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和CancerGeneNet进行的富集分析显示，这些核心靶点与侵袭性癌症表型相关的关键生物学通路有强关联，包括细胞生长、凋亡和运动等，这些关联随后在体外实验中证实受CGs影响。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）图谱识别出10个枢纽靶点——MTOR、PTGS2、ALB、ICAM1、SYK、PRKCA、MAPK14、MET、PRKCB和MAP2K1——它们在功能上相互关联且与临床结局相关。分子对接和分子动力学模拟支持PSN和OUA与这些靶点（尤其是MTOR和PTGS2）的高亲和力结合。一致地，两种化合物在体外均抑制了MTOR和PTGS2相关的下游信号传导。
Conclusion
本研究阐明了CGs可能发挥抗LSCs活性的多种机制，这对于设计AML新型治疗策略至关重要。所提出的计算机模拟框架具有广泛适用性，可加速AML及其他癌症中的药物重定位进程。
Introduction
急性髓系白血病（AML）被认为是临床上最具侵袭性的白血病类型，约占白血病相关死亡的一半，诊断中位年龄约为69岁。2021年，AML在全球造成14.5万新发病例和13万死亡病例，其发病率和死亡率呈持续上升趋势，反映了其高致死率。AML由未成熟髓系原始细胞的失控增殖驱动，导致其在外周血和骨髓中积累。AML治疗策略已显著发展——从传统的细胞毒性化疗和造血干细胞移植到更新的7+3方案，以及FDA批准的靶向治疗，如FLT3-ITD抑制剂和BCL2抑制剂。然而，AML患者的长期生存率仍然较差，5年生存率约为29%。此外，60岁以上患者的结局明显更差，5年生存率低于15%。随着AML发病率逐渐增加，而长期生存率的改善有限，亟需用于AML的新型治疗药物。
开发临床可行药物的过程极具挑战性，仅有3.4%的肿瘤候选化合物最终进入临床评估。为了加速药物开发，最有效的途径之一是将临床批准的非肿瘤药物重新用于癌症治疗——这一策略通常被称为药物重定位。强心苷（CGs）传统上用作治疗充血性心力衰竭和心律失常等心脏疾病的Na+ /K+ -ATP酶抑制剂，在多种实体瘤和血液恶性肿瘤中显示出有前景的抗肿瘤活性，得到大量实验和临床研究的支持。癌症的多个标志，即持续的细胞增殖、凋亡抵抗和激活的细胞运动，已在多个临床前模型中被证明可被CGs改变。流行病学研究表明，心力衰竭患者的CG治疗与较低的乳腺癌和前列腺癌风险相关，支持其抗癌潜力。特别是在AML中，通过对白血病干细胞（LSCs）基因特征的计算分析，CGs已被确定为新的候选药物，LSCs是AML复发和化疗耐药的关键贡献者。我们先前报道，哇巴因（OUA）在我们研究中被确定为最有效的CGs，对AML细胞具有强烈的细胞毒性作用，对LSCs和白血病祖细胞（LPCs）具有优先活性，而对正常造血干细胞（HSCs）影响最小。类似地，原海葱苷原（PSN）在临床相关剂量下，被证明在高MYC表达的白血病细胞（包括AML LSCs）中具有抗癌活性。此外，PSN已被报道为在针对多种癌症（包括胶质母细胞瘤、结肠癌和胰腺癌细胞）的多个筛选中最有效的CGs之一。由于靶向LSCs现已成为治愈AML的关键策略，选择两种强效且高选择性的CGs，OUA和PSN，作为候选药物进行进一步计算分析，以加速对CGs在AML中分子相互作用和机制的全面理解，这些机制尚未完全阐明。
在本研究中，我们使用计算机模拟网络药理学方法，如图1所示，识别OUA和PSN在AML中高度特异性的共同分子靶点，并探索CGs如何影响与AML侵袭性相关的多个通路。还揭示了具有AML临床相关性的枢纽靶点，并通过分子对接进一步评估了它们与OUA和PSN的潜在相互作用。我们的发现不仅为CGs（特别是OUA和PSN）的临床转化提供了基础，也为进一步开发其他靶向LSCs的新策略提供了依据。
Material and Methods
Compound Preparation and Target Prediction
如前所述，选择OUA和PSN作为本研究中的候选药物；它们的化学信息从PubChem获得，分别使用化合物标识符（CIDs）439501和5284613。PSN和OUA的结构使用DrugBank进行可视化表示。为了预测潜在的分子靶点，将化合物的SMILES表示上传到SwissTargetPrediction数据库。PSN和OUA共享的关键分子靶点（PSN–OUA交叉靶点）使用Venny 2.1.0通过维恩图可视化。
Shared PSN–OUA and AML-Associated Targets
为了全面识别AML相关的治疗靶点，使用DisGeNET和GeneCards数据库，以“急性髓系白血病”为关键词，进行计算机模拟高通量筛选。合并两个基因集，去除冗余，生成候选基因的 refined 列表。然后将该列表与PSN–OUA交叉靶点相交，以识别与AML最相关的共享靶点。使用Venny 2.1.0通过维恩图可视化交集。随后，使用Cytoscape 3.10.3构建化合物-靶点网络，以映射CGs（PSN和OUA）与AML相关分子靶点之间的关键相互作用。
Functional Annotation and Enrichment Analyses
为了研究与PSN–OUA在AML中靶点相关的关键通路，使用DAVID工具进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。我们按y轴上的–log10 P值对条目进行排序，并在x轴上绘制富集倍数，提供最显著功能类别的直观且信息丰富的概览。使用SRplot创建气泡图和桑基图。
此外，使用CancerGeneNet数据库分析相同的基因集，以检查与典型癌症标志相关通路的关联。通过“Connect Proteins”模块提交基因名称，网络复杂度设置为级别3（全部）以进行全面 mapping。为了可视化，在“宽松”设置下应用最小相互作用分数0.7，便于解释功能关系以及这些基因对癌症侵袭性的潜在贡献。
Construction of Network and Identification of Hub Targets
为了识别驱动网络连接性的枢纽分子，采用三层次聚类策略。首先，使用STRING 12.0数据库通过“Multiple Proteins”分析工具构建初级蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。提交PSN–OUA和AML重叠基因的整理列表，生物体设置为智人。保留置信度分数大于0.4的相互作用以确保中等或更高的可靠性。在 resulting 网络中，节点代表蛋白质，边代表蛋白质-蛋白质关联。其次，使用Cytoscape软件 refined 核心分子相互作用景观，以进一步探索从STRING输出导出的连接模式。将网络数据以TSV格式导入作为分子相互作用网络。最后，使用cytoHubba评估每个节点的拓扑意义。使用度中心性对网络节点进行排序，并选择前10个枢纽基因——具有最高直接连接数的基因——用于后续分析。
Molecular Docking
进行分子对接以研究PSN和OUA与来自PPI的前10个枢纽靶点之间的结合特异性。PSN和OUA的3D结构以SDF格式从PubChem数据库下载。蛋白质结构从RCSB蛋白质数据库（PDB）检索，包括MTOR（PDB ID: 4JSV）、PTGS2（PDB ID: 5F1A）、ALB（PDB ID: 1AO6）、ICAM1（PDB ID: 1IC1）、SYK（PDB ID: 4FL2）、PRKCA（PDB ID: 2GZV）、MAPK14（PDB ID: 6SFO）、MET（PDB ID: 3DKG）、PRKCB（PDB ID: 2I0E）和MAP2K1（PDB ID: 3W8Q）。使用CB-Dock2网络服务器进行分子对接模拟，该服务器基于AutoDock Vina执行自动空腔检测 followed by 盲对接。对于每个靶点-化合物对，生成五个预测结合空腔，并选择最佳拟合口袋（CurPocket）内具有最低Vina分数的对接构象在本研究中呈现。结合亲和力以kcal/mol表示。对接复合物以3D可视化，受体表面隐藏以突出配体-靶点界面。氢键显示为实心蓝色虚线，弱氢键显示为浅蓝色虚线。使用分子动力学（MD）模拟验证前两个预测靶点。为了进一步支持分子对接结果，还测试了PSN和OUA对预测靶点的生物活性。
MD Simulation
使用GROMACS 2021.7和CHARMM36力场进行MD模拟，以评估PSN与预测的癌症靶点MTOR和PTGS2之间的蛋白质-配体复合物的稳定性。对于MTOR，使用对应于预测结合位点的配体相互作用功能域进行MD模拟。使用CGenFF服务器基于从ORCA计算获得的优化几何结构生成配体参数。每个蛋白质-配体复合物在填充有TIP3P水分子的立方体模拟盒中溶剂化，并添加适当的抗衡离子以中和系统。使用最陡下降法进行能量最小化，直到最大力低于1000 kJ/mol·nm， followed by 系统平衡分两个阶段进行：100-ps NVT系综在300 K和100-ps NPT系综在1 bar下使用Parrinello–Rahman气压计。随后进行100 ns的生产MD模拟，积分时间步长为2 fs。使用标准GROMACS分析工具进行模拟后轨迹分析，包括骨架和配体均方根偏差（RMSD）计算，并使用GraphPad Prism生成RMSD图。
Evaluation of Clinical Associations and Disease Relevance
为了探索前10个枢纽基因的临床相关性，我们分析了它们在AML患者中的mRNA表达模式和预后意义。通过GEPIA获得表达数据，这是一个整合了来自癌症基因组图谱（TCGA）和基因型-组织表达（GTEx）数据库的RNA-seq数据的基于网络的平台。肿瘤样本（N = 173）来自TCGA-LAML数据集，而正常组织数据（N = 70）来自GTEx。使用|Log2 FC|阈值1评估差异表达，统计显著性定义为P < 0.01。为了评估预后价值，使用Kaplan–Meier Plotter进行总生存期分析，对每个基因应用JetSet最佳探针集：MTOR（探针ID: 202288_at）、PTGS2（探针ID: 204748_at）、ALB（探针ID: 211298_s_at）、ICAM1（探针ID: 202638_s_at）、SYK（探针ID: 226068_at）、PRKCA（探针ID: 213093_at）、MAPK14（探针ID: 202530_at）、MET（探针ID: 203510_at）、PRKCB（探针ID: 207957_s_at）和MAP2K1（探针ID: 202670_at）。根据上下四分位数将基因表达分为高和低组，共包括1,608名患者。使用对数秩检验计算P值，并获得风险比（HR）。
Reagents
PSN和OUA购自Sigma-Aldrich。储备溶液在无菌条件下制备，分装并在-20°C下储存。
Cell Culture
人AML来源的细胞系，包括HL-60（JCRB0085）和KG-1（JCRB9051），来自日本研究生物资源细胞库（JCRB）（日本大阪）。HL-60细胞在RPMI-1640培养基中培养，而KG-1细胞在Iscove改良杜尔贝科培养基（IMDM）中维持；两种培养基均补充有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。细胞在37°C、5% CO2 的加湿培养箱中维持。使用MycoAlert™ PLUS支原体检测试剂盒定期检查支原体污染，并丢弃任何受污染的培养物。
Apoptosis Assay
使用Annexin V/7-AAD assay评估细胞凋亡。简要来说，用冷PBS洗涤细胞，并在室温下在结合缓冲液中用PE标记的Annexin V和7-AAD染色，避光。立即使用FACSCanto流式细胞仪分析样品。活细胞被鉴定为Annexin V– /7-AAD– ，而死细胞包括早期凋亡（Annexin V+ /7-AAD– ）、晚期凋亡（Annexin V+ /7-AAD+ ）和坏死（Annexin V– /7-AAD+ ）群体。
Cell Proliferation Assay
基于指定处理下第0、3和5天的相对生长速率评估细胞增殖。将HL-60和KG-1细胞以每孔10,000个细胞和每孔20,000个细胞的密度接种在96孔板中。在每个时间点，向每孔加入10 µL Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂，并在标准细胞培养箱中孵育4小时。使用VICTOR Nivo S多模式酶标仪在450 nm测量吸光度。减去背景吸光度，信号相对于第0天进行标准化。
Cell Motility Assay
使用24孔Transwell系统评估细胞迁移和侵袭，该系统具有8.0 µm孔径的插入物。对于侵袭实验，膜的上表面预涂Matrigel以模拟细胞外基质屏障。用指定条件预处理AML细胞24小时，之后将30,000个处理过的细胞悬浮在无血清培养基中添加到上室，而下室填充完全培养基作为化学引诱剂。孵育48小时后，将迁移或侵袭的细胞转移到96孔板中，用Hoechst 33342染色，并使用倒置荧光显微镜成像。使用ImageJ软件进行定量分析，结果表示为相对于非处理（NTX）对照组的倍数变化。
Western Blotting
用指定浓度的PSN或OUA处理KG-1细胞，然后在补充有蛋白酶抑制剂混合物和苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解缓冲液中裂解， followed by 在4°C孵育1小时。使用BCA测定试剂盒测定蛋白质浓度。通过SDS–PAGE分离蛋白质（30–50 µg）并转移到PVDF膜上。将膜在TBST中的5%脱脂奶粉中于室温封闭2小时，并与一抗在4°C孵育过夜：phospho-mTOR（Ser2448）、mTOR、Raptor、Rictor、G-β-L、COX-2和c-Myc。洗涤后，将膜与HRP标记的二抗在室温孵育2小时。使用ImageQuant™数字成像系统显影条带。β-肌动蛋白作为加载对照。使用ImageJ软件量化条带强度。
RNA Isolation and Quantitative Real-Time PCR (RT-qPCR)
使用TRIzol试剂从KG-1细胞中提取总RNA，并使用NanoDrop 2000分光光度计定量。使用SuperScript III逆转录酶和oligo(dT)引物按照制造商的说明合成互补DNA（cDNA）。使用SYBRTM Select Master Mix在CFX384 Touch实时PCR检测系统上进行定量实时PCR（RT-qPCR）。用于qPCR的引物如下：人PTGES2，正向5′-CCTCTATGAGGCTGCTGACAAG-3′和反向5′-ATCACACGCAGCACGCCATACA-3′；和GAPDH，正向5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′和反向5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。使用2−ΔΔCt 方法计算相对mRNA表达水平，以GAPDH作为内参基因。
Statistical Analysis
数据表示为平均值±标准差（SD）。使用GraphPad Prism进行统计分析，来自五个独立实验。使用单因素方差分析 followed by Dunnett多重比较检验，以及双因素方差分析 followed by Tukey多重比较检验来确定统计显著性。小于0.05的P值被认为具有统计显著性，统计功效>80%，除非另有说明。使用非线性回归模型计算半数抑制浓度（IC50 ）值：log（抑制剂）与归一化反应（可变斜率）。
Results
Identification of Core Molecular Targets of PSN and OUA in AML
CGs因其对AML的抗肿瘤活性，特别是靶向LSCs，而重新引起关注。然而，其精确的分子靶点，对于进一步的药物设计至关重要，仍然定义不清。PSN和OUA是两种具有抗LSC活性的明确表征的CGs，被用作候选药物来预测共同的抗LSC靶点。使用SwissTargetPrediction，分别基于PSN和OUA的化学结构识别了100个靶点。然后，将PSN和OUA的两组数据相交以识别共享分子。 resulting 24个重叠候选物，表示为PSN–OUA靶点，显示在维恩图中并列于表1中。为了提高AML的靶点特异性，将PSN–OUA靶点与从DisGeNET和GeneCards使用关键词“急性髓系白血病”检索到的总共10,077个AML相关靶点相交，并在维恩图中可视化。 resulting 17个重叠靶点——MTOR、MAPK14、PRF1、DHODH、MET、PRKCA、ADORA2A、PTGS2、SYK、ICAM1、MAP2K1、BCL2A1、PDE5A、PRKCB、PRKCE、PRKCH和ALB——可能代表PSN–OUA在AML中的核心靶点。使用Cytoscape构建化合物-靶点相互作用网络。该网络包含18个节点和17条边，17个核心靶点显示为绿色椭圆，PSN–OUA显示为橙色圆角矩形。总之，识别了一组预测的CGs在AML中的核心靶点。
GO Enrichment Analysis Highlights the Biological Significance of PSN–OUA Targets in AML
为了进一步探索PSN–OUA在AML中的生物学功能，我们将识别出的17个核心靶点提交给DAVID工具进行GO富集分析。GO数据分为三个主要方面：生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。对于BP，57个GO条目中有45个具有统计显著性（P < 0.05）。其中，凋亡过程（GO:0006915）和信号转导（GO:0007165）涉及最大数量的靶基因——每组7个。与凋亡过程相关的基因是BCL2A1、ADORA2A、PRKCB、PRKCE、PRF1、PRKCA和MAPK14，而与信号转导相关的基因包括MAP2K1、PRKCH、PRKCB、PRKCE、PDE5A、MAPK1 4 和 M E T
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