自然界中，蝾螈（axolotl）以其非凡的器官再生能力而闻名，能够完美再生包括尾巴和四肢在内的复杂结构。这些再生的器官包含相似的肌肉、真皮和骨骼等中胚层组织。然而，一个长期悬而未解的核心科学问题是：再生初级体轴（如尾巴）和再生附肢（如四肢），是否采用了相同的干细胞机制？解答这个问题，对于理解再生生物学的基本原理以及推动再生医学的发展至关重要。以往的研究表明，在四肢再生过程中，谱系限制性的祖细胞/干细胞贡献于芽基（blastema）并再生出相应的组织，肌肉干细胞（Muscle Stem Cells, MuSCs）通常被认为是单能性的，主要再生肌肉。相比之下，人们对尾部再生的细胞起源了解仍然有限。尾部再生涉及脊椎、分段肌肉等初级体轴组织的重建，其过程可能更为古老和基础。因此，比较尾部与四肢再生中MuSCs的行为，可能揭示再生策略的进化差异和细胞潜能调控的深层机制。近期，发表在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）上的一项研究，通过精巧的实验设计，深入探究了这一问题，揭示了蝾螈尾部与四肢再生中MuSCs命运调控的根本差异，并确定了转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β, TGF-β）信号通路在这一过程中的核心调控作用。
为了回答上述问题，研究人员综合运用了多种前沿技术。他们首先构建了多种转基因蝾螈品系，特别是利用CRISPR-Cas9技术敲入或利用转座子系统构建了诱导型谱系追踪系统（如dTG-Pax7, dTG-Myf5），用于特异性标记和追踪Pax7+或Myf5+的肌肉干细胞及其后代。核心实验技术包括：（1）遗传谱系追踪（Genetic Fate Mapping），通过他莫昔芬（tamoxifen）诱导Cre重组酶活性，永久标记特定细胞群，观察其在发育和再生过程中的命运；（2）单细胞移植（Single-Cell Transplantation），将荧光标记的单个MuSCs移植到宿主蝾螈体内，在单细胞水平上验证其多能性；（3）单细胞RNA测序（Single-Cell RNA Sequencing, scRNA-seq，采用Smart-seq2方法），对再生不同时间点的MuSCs及其后代进行转录组分析，揭示细胞状态转变和分子路径；（4）药理学和遗传学操作，使用小分子抑制剂（如SB-431542抑制TGF-β通路）或在MuSCs中条件性过表达构成型活性TGF-β受体（caTgfbr1）或TGF-β信号拮抗剂Smad7，以调控信号通路并观察对细胞命运的影响；（5）免疫组织化学/免疫荧光（Immunohistochemistry/Immunofluorescence），用于鉴定细胞类型和定位；（6）空间转录组学（Stereo-seq），用于确定胚胎中特定细胞群的空间位置。实验所用蝾螈样本来源于实验室繁殖和饲养的群体。
Pax7+细胞在尾部再生而非发育过程中产生结缔组织谱系
研究人员首先利用dTG-Pax7双转基因蝾螈品系进行谱系追踪。在尾部发育过程中，他莫昔芬诱导标记的Pax7+细胞及其后代仅贡献于肌肉和脊髓谱系。然而，在尾部截肢诱导再生后，这些CHERRY+细胞不仅出现在肌肉中，还广泛出现在再生的鳍、软骨、成纤维细胞、周细胞等结缔组织（CT）中。免疫荧光染色证实了这些细胞表达PRRX1（成纤维细胞标记）、SOX9（软骨细胞标记）、CD34（血管周细胞标记）等。相比之下，在四肢发育和再生过程中，Pax7+细胞始终仅贡献于肌肉谱系。这表明Pax7+细胞获得额外CT谱系的能力是尾部再生所特有的。
MuSCs是尾部再生过程中CT的来源
为了精确确定产生CT谱系的Pax7+细胞类型，研究人员排除了神经干细胞（Sox2+）和成熟肌纤维（MCK+）的贡献。他们进一步构建了dTG-Myf5品系，特异性标记肌源性祖细胞。结果显示，在未受伤尾部，Myf5+细胞仅产生MuSCs和肌肉。但在尾部再生后，这些细胞同样贡献于CT谱系（成纤维细胞、软骨细胞、周细胞）。这强有力地证明MuSCs是尾部再生中CT谱系的来源。
克隆分析揭示MuSCs的异质性和多能性
为了在单细胞水平上验证MuSCs的多能性，研究人员从标记的dTG-Pax7蝾螈尾部分离单个CHERRY+MuSCs（其中87.7%表达PAX7），并将其移植到宿主d/d蝾螈尾部进行再生命运追踪。结果显示，单个移植的MuSC在再生尾部可以产生肌肉、软骨和成纤维细胞中的单一或多种谱系。克隆分析表明尾部MuSCs具有异质性，表现出肌源性或CT源性的单能性，或兼具两者的多能性。
肢体和尾部MuSCs的相互移植揭示潜能差异由细胞内在特性决定
通过将肢体MuSCs移植到宿主尾部进行再生，发现它们即使处于尾部再生环境中，也仅产生肌肉谱系（11/11）。反之，将尾部MuSCs移植到肢体进行再生，它们仍能产生肌肉和CT谱系。这表明MuSCs的分化潜能差异是由细胞内在特性决定的，而非再生微环境。
MuSCs通过中间祖细胞产生CT谱系
通过对再生过程中不同时间点分选的CHERRY+细胞进行scRNA-seq分析，研究人员鉴定出一个“再生活跃区”。在此区域，除了典型的MuSCs、成纤维细胞、软骨细胞外，还发现了两个新的中间细胞（Intermediate Cells, IM1和IM2）亚群。它们同时表达MuSCs标记（如Pax7, Myf5）和CT细胞标记（如Prrx1）。时序分析显示，在再生早期（2-6天），MuSCs向IM1转变；在再生后期，IM1进一步分化为IM2，继而产生CT细胞或补充消耗的MuSCs。RNA速率（RNA velocity）和轨迹推断（trajectory inference）分析均支持从MuSCs到IMs，再到CT细胞的分化路径。这表明IMs是再生诱导的、来源于MuSCs的中间祖细胞，是产生CT谱系的直接来源。
中间祖细胞的状态和谱系类似于早期胚胎多能中胚层细胞
研究人员发现，在蝾螈胚胎早期（阶段15-25），Pax7+的胚胎祖细胞（EPrCs）能够短暂地产生CT谱系（如真皮、成纤维细胞），但随着发育进行（阶段30以后），这种能力减弱或消失。将胚胎EPrCs的scRNA-seq数据与再生IMs的数据整合分析发现，IMs与早期中胚层来源的EPrCs在基因表达谱上高度相似。空间转录组学分析进一步证实EPrCs主要位于胚胎中胚层区域，而非神经嵴区域。这表明尾部再生中的MuSCs通过逆转为类似早期胚胎中胚层多能细胞的状态来获得多能性。
TGF-β信号通路调控肌源性MuSCs的细胞命运转换
对MuSCs和IMs亚群进行通路活性分析发现，TGF-β、Wnt和MAPK通路活性在倾向于分化为成纤维细胞或肌肉的亚群中存在显著差异。进一步的实验表明，使用TGF-β通路抑制剂SB-431542处理再生中的蝾螈，显著减少了MuSCs产生成纤维细胞的比例，并缩短了鳍的再生长度，而抑制Wnt或MAPK通路则无此效果。更重要的是，研究人员通过遗传学方法，在MuSCs中条件性过表达Smad7（抑制TGF-β信号）或构成型活性caTgfbr1（激活TGF-β信号）。结果发现，抑制TGF-β信号几乎完全阻断了MuSCs向CT谱系的分化，使其仅产生肌肉；而激活TGF-β信号则驱使MuSCs偏向于CT谱系，肌肉生成减少。这证明TGF-β信号水平是调控MuSCs在再生过程中向肌肉或CT谱系分化的关键决定因素。
本研究通过系统的在体功能研究，揭示了蝾螈尾部与四肢再生中MuSCs命运决定的根本差异。尾部MuSCs在再生信号刺激下，能够发生命运重编程，逆转为一种多能的、类似于胚胎中胚层祖细胞的状态（IMs），进而贡献于肌肉和多种结缔组织谱系的再生。这种可塑性是尾部再生所特有的，在四肢再生中并未观察到。研究进一步将这种细胞命运的“开关”与TGF-β信号通路的活性水平直接联系起来，表明较高的TGF-β信号促进MuSCs向CT谱系分化，而较低的信号水平则利于肌肉生成。从进化发育（Evo-Devo）的角度看，初级体轴（尾）的出现远早于附肢（肢），其再生机制可能更为古老和基础，MuSCs的这种可塑性或许反映了这种进化上的古老特性。这项研究不仅深化了对复杂器官再生细胞和分子机制的理解，揭示了不同身体部位再生策略的差异性，而且为再生医学中操控干细胞命运、促进功能性组织再生提供了重要的理论依据和潜在的干预靶点。
