摘要
月经中毒性休克综合征（mTSS）是一种罕见但危及生命的疾病，由金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）释放的毒性休克综合征毒素-1（TSST-1）超抗原引发。尽管长期使用阴道内产品是已知风险因素，但阴道微生物组也可能影响mTSS的发生。先前研究发现，月经液中金黄色葡萄球菌的存在与念珠菌属（尤其是白色念珠菌Candida albicans）的同时存在相关。本研究评估了白色念珠菌在刺激TSST-1产生中的潜在作用。研究发现，白色念珠菌的生长耗尽了可利用的葡萄糖，从而缓解了由碳分解代谢物控制蛋白A（CcpA）介导的对编码TSST-1的tst基因的抑制，并使得SaeRS双组分系统得以激活其表达。这些结果强调了阴道微生物组和营养可用性在mTSS背景下对金黄色葡萄球菌毒力调控的重要性。
引言
金黄色葡萄球菌是一种共生细菌，存在于30%的人群中，在10%健康女性的阴道中可检测到。部分金黄色葡萄球菌菌株产生超抗原TSST-1，其在女阴阴道环境中的存在是mTSS的主要风险因素。在月经期间，被血液浸透的阴道内月经产品（如卫生棉条和月经杯）会浓缩阴道生态位中的营养和氧气，可能促进金黄色葡萄球菌的定植、生长以及TSST-1的产生。TSST-1可进入血液，迫使T细胞多克隆激活，导致大量促炎细胞因子释放，引起严重的mTSS症状。
TSST-1由tst基因编码，其产生受多种调节因子控制。CcpA是tst基因主要的葡萄糖依赖性转录抑制因子，与碳分解代谢物抑制（CCR）相关。另一个主要的tst调节因子是SaeRS双组分系统，据报道是tst表达所必需的。此外，群体感应附属基因调节因子（Agr）系统通过激活调节RNA RNAIII的转录来正向调节tst。金黄色葡萄球菌呼吸反应（Srr）系统分别在高氧或低氧条件下增强或抑制tst转录。最后，金黄色葡萄球菌附属调节因子SarA通过直接结合tst启动子和激活RNAIII转录来抑制tst表达。
为了更好地预防mTSS，了解相关风险因素（可能包括阴道微生物组的组成）非常重要。许多研究报告乳酸杆菌属（主要是L. crispatus, L. gasseri和L. jensenii）在健康阴道环境中起保护作用。研究也探讨了阴道微生物组中的物种如何影响金黄色葡萄球菌产生TSST-1，揭示惰性乳酸杆菌和阴道加德纳菌可能会加剧毒素产生和免疫激活。尽管有结果提示真菌在塑造阴道微生物组中的潜在重要性，但目前对阴道生态位中真菌与金黄色葡萄球菌之间分子相互作用的了解甚少。Jacquemond等人先前证明，月经期间金黄色葡萄球菌的存在与球链菌属、普雷沃菌属、加德纳菌属和念珠菌属的存在有强烈的正相关。值得注意的是，白色念珠菌平均占阴道念珠菌物种和整体真菌种群的60%。
在本研究中，我们探索了白色念珠菌在分子水平上调控金黄色葡萄球菌产生TSST-1，进而在mTSS发展中的作用。我们使用了影响葡萄糖利用的白色念珠菌突变体、不同葡萄糖水平的培养基以及金黄色葡萄球菌突变菌株，以评估葡萄糖可用性对微生物相互作用和TSST-1产生的重要性。
结果
白色念珠菌培养上清液刺激金黄色葡萄球菌产生TSST-1
为建立研究白色念珠菌与金黄色葡萄球菌相互作用的实验模型，每种生物被单独培养或共培养。金黄色葡萄球菌也与脑心浸液（BHI）对照培养基或白色念珠菌培养上清液一起孵育。在所有条件下，白色念珠菌和金黄色葡萄球菌均显示出典型的生长曲线。与白色念珠菌共培养或与其上清液接触的金黄色葡萄球菌，其TSST-1产量在接触6小时和8小时后显著增加。这些结果表明，在这种相互作用模型中，白色念珠菌不干扰金黄色葡萄球菌的生长，且其自身及其培养上清液均能类似地显著刺激金黄色葡萄球菌产生TSST-1。白色念珠菌对TSST-1产生的这种影响可能是通过酵母改变培养基介导的，而不是酵母与细菌之间的直接相互作用。
TSST-1产生的刺激由耐热低分子量分子介导且不依赖于pH变化
为了评估白色念珠菌上清液的刺激活性是否由热敏感物质介导，对真菌上清液进行了不同温度的热处理。没有一种热处理显著改变白色念珠菌上清液刺激TSST-1产生的能力。接下来，通过连续过滤（10 kDa和3 kDa截留分子量）来鉴定刺激TSST-1产生的分子介质的分子量。分子量截留没有显示出显著效应。总体而言，这些结果表明TSST-1产生的刺激可能是通过低分子量、耐热肽、化合物或离子的积累或耗竭发生的。
阴道低pH值可防止病原体增殖。为了评估pH变化在调节TSST-1产生中的作用，将白色念珠菌培养上清液的pH调整至基础BHI培养基的pH值，反之亦然。基础TSST-1产量在pH 7.2与7.8的对照BHI培养基之间没有显著差异。类似地，与未经处理的pH 7.8的上清液相比，将真菌上清液pH降低至7.2并未显著影响其对TSST-1产生的刺激。白色念珠菌上清液仅在缓冲至pH 5.5至7之间时才显著刺激TSST-1产生。尽管变异性高，这些结果表明pH本身可能不是刺激TSST-1产生的直接原因，但确实干扰了基础的TSST-1产生。总结这些初步结果，白色念珠菌上清液对金黄色葡萄球菌TSST-1的刺激似乎是通过低分子量、耐热分子的积累或耗竭介导的，与白色念珠菌的pH调节无关。
TSST-1产生的刺激与培养基中葡萄糖耗竭相关
由于TSST-1的产生受葡萄糖水平控制，接下来研究了TSST-1产生的刺激是否由白色念珠菌消耗葡萄糖驱动。白色念珠菌菌株SC5314 WT在BHI培养基中培养长达18小时。随着培养时间增加，真菌上清液中的葡萄糖水平显著下降，并在培养12小时后降至检测不到的水平。与白色念珠菌12小时培养上清液孵育后，金黄色葡萄球菌的TSST-1产量显著增加。这表明白色念珠菌介导的对金黄色葡萄球菌TSST-1产生的刺激可能与真菌生长阶段和培养基中的葡萄糖水平相关。
为了确认葡萄糖在我们相互作用模型中对TSST-1产生的影响，将从白色念珠菌18小时培养获得的上清液逐渐补充葡萄糖。葡萄糖补充范围在0 mM至4.2 mM之间的上清液显著调节了TSST-1的产生。补充较高葡萄糖的上清液与低TSST-1产量相关，与在对照BHI培养基中孵育获得的TSST-1产量无显著差异。
尽管白色念珠菌上清液中的葡萄糖水平明显影响金黄色葡萄球菌的TSST-1产量，但不能排除上清液中积累或耗竭的其他分子可能参与TSST-1的产生。因此，使用实验室自制（LM）BHI（补充0 mM、5.5 mM和16.7 mM葡萄糖）进行了进一步测试，以确认葡萄糖是否是我们相互作用模型中TSST-1产生刺激的唯一调节因子。基础TSST-1产量在对照LM-G0和LM-G5.5mM BHI培养基中显著高于标准BHI和LM-G16.7mM BHI。仅当白色念珠菌在标准BHI、LM-G5.5mM和LM-G16.7mM BHI中生长时，其上清液对TSST-1产生的刺激才显著高于对照。在无葡萄糖LM BHI中生长的酵母上清液对TSST-1产生无显著影响。总体而言，这些结果表明，在目前白色念珠菌与金黄色葡萄球菌的相互作用模型中，白色念珠菌上清液刺激金黄色葡萄球菌产生TSST-1主要是由于葡萄糖水平。
CcpA和SaeRS控制金黄色葡萄球菌在接触白色念珠菌培养上清液时的TSST-1产生
在金黄色葡萄球菌中，葡萄糖介导的tst表达抑制由CcpA控制。为了确认CcpA控制的葡萄糖介导的TSST-1产生抑制，并进一步研究该相互作用模型中tst基因的调控，将缺乏ccpA基因或其他已知tst表达调节因子（即agr、rot、saeS、srr和sarA）的金黄色葡萄球菌菌株与白色念珠菌上清液或对照标准BHI培养基一起孵育。只有ΔccpA和ΔsaeRS突变体显示出与野生型（WT）不同的TSST-1产生谱。具体来说，ΔccpA在用白色念珠菌上清液和对照BHI培养基时均显示出较高的基础TSST-1产量，而ΔsaeRS菌株显示出低至无TSST-1产量。Δagr、Δrot和Δsrr菌株显示出与WT相似的基础TSST-1产量。此外，ΔsarA产生的谱与WT菌株相似，尽管接触SCA后ΔsarA菌株的TSST-1产量显著高于WT菌株。
白色念珠菌刺激TSST-1产生涉及真菌Hxk2p的己糖激酶活性
使用野生型和缓慢耗竭葡萄糖的白色念珠菌突变菌株来确认葡萄糖耗竭是由于白色念珠菌生长和代谢所致。HXK2基因编码己糖激酶Hxk2p，这是白色念珠菌中三种葡萄糖磷酸化酶之一，确保葡萄糖的输入和磷酸化，这是糖酵解的第一步。删除两个HXK2等位基因会导致培养基中葡萄糖耗竭速度变慢。野生型、Cahxk2Δ/Δ和回补（Cahxk2Δ/Δ c/c）菌株显示出随时间推移的相似生长。培养12小时后，与野生型和回补菌株相比，Cahxk2Δ/Δ菌株的剩余葡萄糖浓度显著更高。培养16小时时，所有三种菌株的葡萄糖浓度均检测不到。金黄色葡萄球菌的TSST-1产量与上清液中的葡萄糖水平呈负相关。实际上，与暴露于野生型和回补菌株的12小时上清液相比，暴露于Cahxk2Δ/Δ的12小时上清液的金黄色葡萄球菌产生的TSST-1显著更少。然而，所有三种菌株的16小时培养上清液都将金黄色葡萄球菌的TSST-1产量提高到了相同水平。
除了其酶活性外，Hxk2p还是一种转录调节因子，控制葡萄糖抑制基因的表达，与白色念珠菌的CCR相关。为了评估哪种功能影响TSST-1产生的刺激，培养了缺乏Hxp2p调节活性（Cahxk2T15A）或催化活性（Cahxk2D210A）的酵母突变菌株。在12小时和16小时，Cahxk2D210A菌株显示出与Cahxk2Δ/Δ菌株相似的生长和葡萄糖耗竭谱。相比之下，Cahxk2T15A菌株显示出与野生型和Cahxk2Δ/Δ c/c菌株相似的12小时和16小时生长和葡萄糖耗竭谱。在培养12小时时，Cahxk2Δ/Δ和Cahxk2D210A菌株的培养上清液未能将TSST-1刺激到与从野生型、回补和Cahxk2T15A菌株获得的上清液相同的程度。这种菌株间的差异在培养16小时时消失，此时所有五种菌株都将TSST-1产量刺激到相似水平。这些发现证实，白色念珠菌的葡萄糖代谢导致培养基中葡萄糖耗竭，这一过程部分依赖于Hxk2p的酶功能。此外，正是这种耗竭根据我们的相互作用模型提高了金黄色葡萄球菌的TSST-1产量。
总体而言，基于我们金黄色葡萄球菌与白色念珠菌培养上清液的相互作用模型，我们表明TSST-1产量增加了2到5倍，并且这种刺激主要取决于培养基中的葡萄糖水平。白色念珠菌在其生长过程中耗竭葡萄糖水平，使得CcpA介导的tst基因葡萄糖抑制早期解除，从而允许SaeRS驱动的基因表达，促进TSST-1产生。
讨论
mTSS是一种罕见的严重疾病。虽然对安全使用阴道内月经产品的认识有所提高，但其他较难控制的因素，如阴道微生物组，可能会影响mTSS风险。在本研究中，我们证明了机会性真菌病原体白色念珠菌可能促进金黄色葡萄球菌的毒力。具体而言，白色念珠菌耗竭葡萄糖水平，从而解除了由CcpA介导的tst基因的CCR，进而使得SaeRS驱动的tst转录得以进行。
在我们的研究中，葡萄糖耗竭被确定为刺激白色念珠菌与金黄色葡萄球菌相互作用中TSST-1产生的主要信号。宫颈阴道粘液中的葡萄糖水平在月经周期中变化，在排卵后期达到约4.4-8.3 mM的峰值。血液中平均葡萄糖水平据报道约为6 mM。月经液样本中的确切葡萄糖浓度尚未有报道。葡萄糖可用性的改变可能导致TSST-1产生的剧烈变化，并在月经期间增加mTSS风险。阴道葡萄糖也来源于糖原，这是一种由阴道和宫颈上皮细胞产生的大分子支链葡萄糖聚合物。糖原可以被局部微生物组，尤其是乳酸杆菌属物种分解为葡萄糖。糖原对乳酸产生和乳酸杆菌定植至关重要，但乳酸杆菌丰度的破坏可导致阴道菌群失调和病原体增殖。糖原也可以被阴道病原体如加德纳菌属物种和白色念珠菌降解。目前没有报告描述金黄色葡萄球菌的糖原转运和降解及其对毒力和代谢的潜在影响。因此，仍需要更多关于阴道微生物组如何代谢阴道营养物质及其对金黄色葡萄球菌等病原体毒力影响的研究。
尽管我们目前的分析表明TSST-1产生主要受葡萄糖水平影响，但我们不能排除其他代谢物的潜在影响，这些代谢物可能包括天然存在的氨基酸、氨基酸衍生的代谢物和热稳定肽。需要进一步的研究来探索白色念珠菌与金黄色葡萄球菌相互作用的全外代谢组及其对TSST-1产生和金黄色葡萄球菌整体毒力的影响。此外，月经液的分子组成与BHI培养基不同，尽管它们具有相似的中性pH和各种营养源。虽然先前的研究使用了模拟阴道和宫颈分泌物的培养基，但尚未发表代表月经液的定义培养基。
在我们的相互作用模型中，似乎只有CcpA显著参与了白色念珠菌对TSST-1产生的刺激，因为SaeRS可能独立于白色念珠菌和葡萄糖耗竭激活tst表达。ccpA和saeRS的缺失产生的结果与先前发表的发现一致，即CcpA是tst的主要抑制因子，而SaeRS是tst表达的主要激活因子。另一方面，在我们的实验条件下，agr和rot的缺失并未导致TSST-1产生的改变。Agr和Rot是包括TSST-1在内的外毒素产生的已知调节因子。Tuffs等人证明，Rot的过度表达导致低水平的tst表达，而野生型水平的Rot似乎在MN8菌株中能够实现相对较高的tst表达。证实这些结果，Dufresne等人表明，在模拟阴道液的培养基中，rot的缺失也导致较低的tst转录；他们还报告在VDM中生长的Δagr菌株中没有tst表达。
在其他描述的tst调节因子中，据报道氧化还原敏感的SrrAB系统根据氧水平调节tst表达。SrrAB似乎在微氧条件下抑制tst表达，并在有氧条件下增强tst表达。Dufresne等人报告，在有氧条件下，MN8 ΔsrrAB菌株的tst表达几乎完全消失。阴道内月经产品使得氧气能够进入微需氧的阴道环境，这样SrrAB可能失活，从而使得TSST-1得以产生。我们的相互作用模型在有氧条件下维持，这与mTSS相关；因此，没有SrrAB介导的tst表达抑制与先前关于微氧条件下TSST-1抑制的观察结果一致。最后，尽管先前的报告已经证明了SarA在直接和间接调节TSST-1产生中的作用，但在我们目前的研究中，sarA的缺失并未改变白色念珠菌培养上清液对TSST-1产生的刺激。
此外，我们使用了真菌Hxk2p的变体来确认葡萄糖耗竭确实是由白色念珠菌消耗葡萄糖和代谢引起的。我们的结果表明，这一过程需要Hxk2p的酶活性，但不需要其调节活性。在白色念珠菌中，Hxk2p已被报道为共调节因子，与两种转录因子Mig1p和Mig2p一起控制与CCR相关的各种基因的表达，这两种转录因子在葡萄糖水平高时被激活。在我们的研究中，Hxk2p调节活性的损害可能不足以改变CCR。使用缺失MIG1、MIG2和HXK2的白色念珠菌菌株进行进一步研究，可能有助于更好地解读CCR扰动对白色念珠菌与金黄色葡萄球菌相互作用的可能影响。
先前对白色念珠菌-金黄色葡萄球菌相互作用的研究描述了在与白色念珠菌共培养期间，金黄色葡萄球菌的α-毒素（或α-溶血素）产生受到刺激。另一项研究揭示了核糖在这种相互作用中的重要性，核糖在共培养期间被白色念珠菌消耗，并通过不清楚的分子机制使得Agr激活。现有文献中没有关于阴道粘膜内核糖浓度的报告，这进一步强调了需要对阴道和月经液的精确代谢物组成进行更多研究。值得注意的是，在我们的相互作用模型中，pH碱化、agr和rot对于刺激TSST-1产生不是必需的，这可能暗示涉及不同的分子机制。
在本研究中，我们只检查了白色念珠菌对金黄色葡萄球菌的影响，而不是相反的影响，因为调查集中在TSST-1产生和mTSS。此外，本研究专门设计用于关注白色念珠菌培养上清液对金黄色葡萄球菌TSST-1产生的影响。尽管在这种模型和共培养之间，TSST-1产生没有差异，但两种生物体之间的相互作用可能涉及基于分子串扰的其他机制。此外，我们只研究了白色念珠菌与金黄色葡萄球菌之间的相互作用，因为白色念珠菌占念珠菌物种和阴道微生物组整体真菌种群的大部分。然而，月经分泌物中葡萄糖水平的降低可能并非白色念珠菌特有，很可能阴道微生物组中的其他微生物也可以在金黄色葡萄球菌存在时降低葡萄糖水平并诱导TSST-1产生的刺激。MacPhee等人证明，在BHI中培养的无乳链球菌培养上清液显著增加了tst表达，而阴道加德纳菌和惰性乳酸杆菌的培养上清液降低了tst表达。Maduta等人表明，在VDM中培养的惰性乳酸杆菌和阴道加德纳菌的上清液能够增加MN8 ΔccpA菌株的TSST-1产量，并增强WT和MN8 ΔccpA菌株的T细胞活化。这些研究没有调查微生物培养上清液中的葡萄糖水平。尽管存在不一致之处（可能是由于使用了不同的培养基），但这两项研究都强调了阴道生态系统中微生物相互作用的复杂性，特别是与TSST-1产生、代谢物（包括葡萄糖）可用性以及mTSS发展相关的复杂性。此外，没有发表的报告描述mTSS发展与阴道微生物组中念珠菌物种存在之间的关联。根据先前的研究结果，mTSS的发作和发展可能与可从月经液中分离的阴道微生物组的具体组成有关，包括白色念珠菌。由于白色念珠菌约占阴道真菌总种群的65%，并且由于其高效的营养摄取能力，尤其是葡萄糖，它可能与金黄色葡萄球菌一起在月经血中快速定植和增殖。这可能意味着白色念珠菌可以加速葡萄糖耗竭，导致早期解除金黄色葡萄球菌中CcpA介导的tst表达抑制，从而使得产生更多的TSST-1并引发mTSS。
结论
在此，我们证明了白色念珠菌培养上清液可以刺激金黄色葡萄球菌产生TSST-1。这是因为白色念珠菌的生长耗竭了培养基中的葡萄糖水平，从而解除了CcpA对tst基因表达的抑制，并使得SaeRS介导的tst转录得以进行。这些发现强调了阴道微生物组内代谢相互作用在疾病发展中的重要性。鉴于TSST-1在mTSS中的核心作用，我们目前的发现强调了阴道微生物组内的代谢相互作用在这种疾病发展中可能具有的重要性。这项研究也强调了微生物代谢与毒力之间更广泛的概念交叉，表明代谢相互作用可能是影响多微生物感染发作和严重程度的关键参数。
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