通过干血斑进行全基因组测序，用于新生儿梅肯斯病（Menkes disease）及其他36种可治疗的遗传性神经代谢疾病的筛查

Menkes疾病新生儿筛查中全基因组测序（WGS）作为串联质谱（MS/MS）的补充方法，通过优化干血斑DNA提取技术，在4-8.5个月储存样本后仍能检测到全部ATP7A致病突变（包括7种错义、5种剪接位点等），并发现5例 Ohio筛查项目相关基因的致病杂合突变。该方法证实了基因组学在早期诊断Menkes及36种其他神经代谢疾病中的可行性和可靠性，为窗口期内的治疗干预提供新途径。

斯蒂芬·G·卡勒（Stephen G. Kaler）|拉利塔·文卡塔拉曼（Lalitha Venkataraman）|明·T·范（Minh T. Pham）|本杰明·J·肯尼迪（Benjamin J. Kennedy）|穆罕默德·马尔哈巴伊（Mohammad Marhabaie）|丹尼尔·C·科博尔特（Daniel C. Koboldt）

美国基因治疗中心（Center for Gene Therapy, USA）

摘要

目前，俄亥俄州卫生部（Ohio Department of Health）使用串联质谱技术（tandem mass spectrometry）对新生儿进行筛查，以检测36种可治疗的先天性代谢错误。作为生化检测异常婴儿的补充测试，全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）理论上可以减少假阳性结果，有助于及时解决病例问题，在某些情况下甚至能够提供比初步诊断更具体的诊断结果。门克斯病（Menkes disease）是一种X连锁隐性遗传的铜代谢障碍，其预计最低出生发病率约为每34,810名活产男婴中有1例。随着门克斯病治疗方案的最新进展，新生儿筛查（Newborn Screening, NBS）的重要性更加凸显，需要在出生后的前4至6周内识别出这种疾病。我们开发了一种从干血斑中提取DNA的方案，获得了可用于全基因组测序的高质量DNA，并研究了24名已知携带ATP7A变异的受试者。分析范围包括俄亥俄州目前筛查的神经代谢疾病相关基因（共55个基因）以及ATP7A基因（与门克斯病相关）。全基因组测序检测到了所有ATP7A变异，包括7个错义突变、5个剪接位点突变、4个拷贝数变异、4个无义突变、3个插入/缺失突变以及1个错义/剪接位点突变。此外，全基因组测序还在5个与俄亥俄州筛查疾病相关的基因中检测到了5个杂合致病变异。我们的结果证实了这种方法的可行性和可靠性，可用于早期检测门克斯病，并作为串联质谱技术的补充，用于检测其他可治疗的遗传性疾病。

引言

门克斯病是一种X连锁隐性遗传的铜代谢障碍，根据基因组聚合数据库（Genome Aggregation Database, gnomAD）中ATP7A基因的功能丧失变异频率估计，其出生发病率约为每8,664至34,810名活产男婴中有1例。ATP7A基因编码一种重要的铜转运ATP酶[2][3][4]。ClinVar数据库中记录了389个已知或可能致病的ATP7A变异，还有超过700个变异目前尚不明确其致病性。

对于门克斯病新生儿来说，存在一个短暂的治疗窗口期（4至6周），在此期间进行医疗干预可以防止这种致命疾病的发展[2][3][4][5]。早期治疗（出生后28天，校正早产因素）和后期治疗（出现神经系统症状后）都与门克斯病患者的生存率显著提高相关[7]。不出所料，早期无症状治疗能够优化临床结局[3][6][7]。最近的研究表明，跨膜受体LAT1是CuHis的独特转运蛋白，这一发现有助于解释CuHis如何在门克斯病患者体内穿过血脑屏障[8]。CuHis（ZYCUBO®）最近获得了美国食品药品监督管理局（US Food and Drug Administration）的批准，用于治疗门克斯病。

一种新兴的辅助治疗方法——腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）介导的ATP7A基因疗法也显示出巨大潜力，在门克斯病小鼠模型（mottled-brindled）中与CuHis联合使用具有协同治疗效果[9][10]。我们最近开发了一种系统性的AAV基因疗法方案，使用经过密码子优化的ATP7A基因减量版本（AAV9-corsATP7A），结合皮下注射CuHis，使门克斯病小鼠模型的存活率达到了95%，而之前的方案分别为22%和55%[11][10]。

也有研究提出使用基于埃莱斯克莫尔（Elesclomol, ES）的铜化合物治疗门克斯病的可能性[12]，但该化合物的安全性较差[11][12][13]，因此我们认为不适合用于此用途。此外，ES还会促进ATP7A的泛素化和降解[14]，这一特性可能对癌症化疗有益，但对门克斯病的治疗并无帮助，无论现在还是未来。

针对门克斯病的有效治疗方法的发展凸显了新生儿筛查（NBS）的重要性，需要在出生后的前4至6周内识别所有高风险婴儿。遗憾的是，目前尚无法通过基于生化分析（如串联质谱）的干血斑（Dried Blood Spots, DBS）检测方法进行大规模的新生儿筛查。门克斯病具有独特的生化特征（血清铜和铜蓝蛋白水平低），但这些指标在出生后的前几周内并不具有可靠的诊断价值[2][5]。这是因为健康新生儿的血清铜和铜蓝蛋白水平也较低，但这些指标会在出生后的前三个月内逐渐上升[2]。而在门克斯病婴儿中，这些指标始终处于较低水平，等到这些指标能够区分门克斯病和健康新生儿时，治疗窗口期（4至6周）已经错过。相比之下，血浆神经化学指标在新生儿期对门克斯病具有高度敏感性和特异性，反映了多巴胺-β-羟化酶（dopamine-beta-hydroxylase，一种依赖铜的酶）活性不足的影响[3][5]。然而，目前从干血斑检测这些神经化学指标的方法灵敏度不足，无法满足新生儿筛查的需求。

我们之前的研究表明，使用靶向下一代测序技术从盲法采集的干血斑中提取DNA，可以准确检测已知门克斯病患者的ATP7A变异[15]。随着测序技术的进步，现在可以从干血斑样本中提取DNA进行全基因组测序，作为一种检测那些没有可测量生化指标的可治疗疾病的初级方法，既可行又经济高效[16]。

在这项研究中，我们探讨了基因组学方法在检测门克斯病及其他36种俄亥俄州卫生部目前筛查的神经代谢疾病方面的可行性和可靠性。

研究部分

受试者招募和干血斑收集

在获得伦理审查委员会（IRB）批准的书面知情同意书后，从全国儿童医院（Nationwide Children's Hospital, NCH）的门克斯病诊所招募了24名患者参与研究。使用常规血液检测后剩余的几滴血液在NBS滤纸卡上点样。DNA提取前的干血斑样本储存温度为室温，平均储存时间为4.0个月，范围为0.5至8.5个月。

结果

我们开发了一种从干血斑中提取DNA的方案，获得了可用于全基因组测序的高质量DNA（表1）。初始干血斑样本的DNA完整性指数为8.1（满分10分），而全血提取的DNA完整性指数范围为6.9至8.5（图1）。

我们对来自全国儿童医院门克斯病诊所的24名已知携带ATP7A变异的受试者进行了全基因组测序。

讨论

公共卫生新生儿筛查（NBS）项目能够大规模识别需要紧急干预的婴儿遗传疾病。目前，俄亥俄州卫生部使用串联质谱技术（tandem mass spectrometry, MS/MS）对新生儿进行36种罕见但可治疗的先天性代谢错误的筛查。此外，还有一些疾病（如脊髓性肌萎缩症）通过针对性的基于DNA的检测方法进行筛查。

CRediT作者贡献声明

斯蒂芬·G·卡勒（Stephen G. Kaler）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、数据可视化、项目监督、方法学设计、研究实施、资金筹集、概念构思。拉利塔·文卡塔拉曼（Lalitha Venkataraman）：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、方法学设计、研究实施。明·T·范（Minh T. Pham）：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、方法学设计、研究实施。本杰明·J·肯尼迪（Benjamin J. Kennedy）：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、方法学设计、研究实施。穆罕默德·马尔哈巴伊（Mohammad Marhabaie）：撰写 – 审稿

资金来源

美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助项目U01NS129343（SGK）。

全国儿童医院研究所（National Institutes at Nationwide Children's Hospital）资助项目40,301–0008（SGK）。

门克斯病研究基金（Menkes Disease Research Fund）资助项目60,301–0026-1220（SGK）。

Triplett基因治疗奖学金（Triplett Fellowship in Gene Therapy）。

未引用参考文献

[26]

利益冲突声明

无

致谢

我们感谢参与研究的患者及其父母，以及全国儿童医院Steve和Cindy Rasmussen基因组医学研究所的基因组服务实验室（Genomic Services Laboratory of the Steve and Cindy Rasmussen Institute for Genomic Medicine）的支持。