1 引言
茶作为全球广泛消费的饮品，其产业可持续发展高度依赖土壤生态系统功能的维持。长期单一种植导致茶园土壤酸化、养分失衡和微生物多样性降低，进而削弱养分供应能力和生态稳定性。这种酸化部分源于集约化施用的合成氮肥在铵硝化过程中释放氢离子，以及茶树根系分泌的有机酸。此外，连续养分吸收而不补充足量有机质会削弱土壤缓冲能力，加剧酸化进程。在玉米、咖啡和番茄等作物系统中，连作同样会加剧土壤酸化并显著改变微生物群落结构。土壤酸化不仅抑制有益微生物群落功能，还降低作物产量和品质，成为茶园可持续发展的关键限制因素。
在可持续农业实践中，豆科绿肥因其具有生物固氮、养分循环和有机质积累等功能，被视为改善土壤质量的重要途径。已有研究表明，绿肥间作能有效提高土壤有机碳和全氮含量，增强涉及碳、氮、磷循环的关键酶（如脲酶和磷酸酶）活性，并促进微生物群落多样性。近年来，豆科绿肥在茶园系统中的作用日益受到关注。Wang T.等（2023）报道茶园间作豆科植物可通过调控根际微生物群落改善土壤理化性质并提升茶叶品质。Zhou等（2024）进一步证明绿肥间作增强土壤酶活性和细菌多样性，同时改善氨基酸和茶多酚等品质相关代谢物。另一研究表明，间作豆科绿肥显著增加土壤微生物多样性，提高茶叶中氨基酸和可溶性糖含量。在退化茶园中，绿肥与有机改良剂配合同样显示出强大恢复潜力。例如，Jiang等（2019）揭示绿肥与羊粪配施增加微生物生物量和酶活性，促进有机酸分泌，改善土壤肥力。Shao等（2024）指出绿肥覆盖促进土壤有机质积累和碳封存。
总体而言，茶树与豆科植物间作不仅改善土壤理化性质和肥力，还增强酶活性，优化微生物群落结构，间接提升茶叶品质。然而，关于不同豆科物种在老化茶园中的长期效应，特别是其在调控碳、氮、磷循环过程中的作用知之甚少。因此，本研究在40年树龄的福鼎大白茶茶园中间作紫花苜蓿（Medicago sativa, TAL）、毛叶苕子（Vicia villosa, THV）和紫云英（Astragalus sinicus, TMV），系统评估其对茶叶产量、土壤理化性质、酶活性（如脲酶、蔗糖酶、酸/碱性磷酸酶、淀粉酶和过氧化氢酶）及细菌和真菌群落结构的影响，并通过功能预测探讨其在碳-氮-磷循环中的潜在作用。
2 材料与方法
2.1 研究区概况
田间试验于2022年10月建立在江西省经济作物研究所茶园基地（28°22′N, 116°00′E）。该地区属亚热带季风气候，温暖湿润，雨量充沛，无霜期长。供试茶树为40年树龄福鼎大白茶，行距1.5 m，株距20 cm，实施轻修剪管理。试验地土壤源于第四纪红色粘土，属酸性红壤。试验前表层土壤（0–20 cm）分析表明其性质如下：pH 4.48，有机质31.04 g·kg−1，全氮2.59 g·kg−1，全磷2.19 g·kg−1，全钾4.21 g·kg−1，碱解氮130.71 mg·kg−1，有效磷115.34 mg·kg−1，速效钾158.25 mg·kg−1。
2.2 试验设计与处理
供试茶树为40年树龄福鼎大白茶。选择三种豆科绿肥物种：紫花苜蓿（TAL，品种中牟1号）、毛叶苕子（THV，品种徐铁1号）和紫云英（TMV，品种余江大叶子）。以不间作绿肥的裸地为对照（CK）。试验采用随机区组设计，共设3个完全区组。每个区组包含所有4个处理，共12个小区（4处理×3重复），每小区面积134 m²。区内小区连续排列，小区间筑混凝土埂防止处理间水土交换。
绿肥秋播并于翌年春盛花期翻压入土，翻压量基于常规播种量。详细播种率、翻压日期和深度见表1。所用肥料包括菜籽饼（有机质含量约70%）和茶树专用复合肥（N ≥ 18%, P₂O₅ ≥ 8%, K₂O ≥ 12%），施用日期、量和深度亦详见表1。杂草采用人工控制，未使用除草剂。病虫害管理包括定期监测茶树并移除病叶。
2.3 土壤理化性质与酶活性分析
2024年4月2日春茶采摘期间，采用五点混合采样法从每小区0–20 cm土层随机采集土壤样品。此采样仅代表早季土壤状况，未捕捉季节变异。去除粗根和石块后，样品带回实验室风干，过2 mm筛备用。每小区设3重复，每重复内5点土样混合成一个分析样品。风干样品用于土壤养分含量测定。土壤理化性质分析参考《土壤农化分析》方法。测定指标包括：土壤pH（土水比1:2.5，电极法）、有机质（重铬酸钾氧化-外加热法）、全氮（凯氏定氮法）、全磷（酸消解-钼锑抗比色法）、全钾（酸消解-火焰光度法）、碱解氮（碱解扩散法）、有效磷（Olsen法）和速效钾（NH₄OAc提取-火焰光度法）。
采用五点混合法从每重复小区采集新鲜土壤（0–20 cm）。样品立即放入无菌袋，冰上运输，4°C保存待酶活性分析。淀粉酶活性采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定；过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定；脲酶活性采用苯酚-次氯酸钠比色法测定；蔗糖酶活性采用DNS比色法测定；酸性磷酸酶活性采用对硝基苯磷酸盐（pNPP）法测定；碱性磷酸酶活性采用荧光微板法测定以提高灵敏度。茶叶产量通过在各采收期手动采收每小区固定面积（1 m²）内所有一芽一叶新梢评估。记录鲜重并根据种植密度换算为公顷产量。
2.4 微生物群落测序与功能预测
土壤样品采集后立即低温保存，采用FastDNA Spin Kit（MP Biomedicals, USA）提取总DNA。提取DNA浓度和纯度通过NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific, USA）测定。细菌群落扩增16S rRNA基因V3–V4区，引物338F/806R；真菌群落扩增ITS1区，引物ITS1F/ITS2R。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证、纯化后，在Illumina MiSeq平台上进行双端测序（2 × 300 bp）。
原始测序数据使用fastp（v0.18.0）质控，去除含≥10% N碱基、≥50%碱基Phred分数≤20及接头污染的读段。清洁双端读段使用FLASH（v1.2.11）合并为标签，最小重叠10 bp，最大错配率2%。16S扩增子数据最低测序深度37,500标签，ITS数据最低深度70,000标签。后续质量修剪遵循Bokulich等（2013）策略，标签在3 bp滑动窗口内首个低质量碱基（Q ≤ 3）处截断，保留<75%原长序列丢弃。操作分类单元（OTU）在97%相似度下使用USEARCH（v11.0.667）中UPARSE算法聚类，嵌合序列使用UCHIME去除。代表性序列使用RDP朴素贝叶斯分类器对照SILVA（v138.2）和UNITE（v10.0）数据库进行物种注释。Alpha多样性指数（包括Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Pielou均匀度、Good覆盖度和PD-whole-tree）在R中基于mothur在线参考公式计算，稀释曲线和等级丰度曲线使用ggplot2生成。Beta多样性分析通过使用GUniFrac计算加权和非加权UniFrac距离矩阵，同时使用vegan从OTU丰度表计算Jaccard和Bray–Curtis距离矩阵。随后基于这些距离矩阵使用vegan包进行主坐标分析（PCoA）。
非度量多维标度（NMDS）、UPGMA聚类和主成分分析（PCA）使用R中vegan包进行。群落组成差异进一步使用PERMANOVA（Adonis）和ANOSIM评估。细菌功能预测使用PICRUSt2（版本2.5.3）推断KEGG代谢通路，使用BugBase分类微生物表型，使用FAPROTAX（版本1.2.10）分配生态功能群。真菌群落使用PICRUSt2生成MetaCyc通路预测，使用FUNGuild注释功能公会。仅考虑置信度“可能”或“高度可能”的分配以减少误分类。相关性分析使用R软件（版本4.2.1）进行，应用Spearman相关性和冗余分析（RDA）探索微生物群落与土壤养分参数关系。
2.5 数据分析
所有实验数据使用Excel 2019整理，SPSS 26.0软件统计分
