ABSTRACT
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）对抗生素压力表现出显著的耐受性，这种耐受性由复杂的细胞反应和代谢网络所介导，这些网络受众多可快速重塑的基因表达模式控制。耐受性可导致治疗失败和抗生素耐药性的出现。然而，由代谢改变驱动的抗生素耐受性所涉及的基因表达模式仍知之甚少。本研究旨在鉴定参与耐受性发展的核心代谢基因。通过蛋白质组学分析和基因互补实验，研究发现七个耐受菌株共享相似的蛋白质表达谱和耐受机制。七个代谢基因，包括 NWMN_0676-0677、opuCB、gltD、adhE、clpP 和 rarA，被证实是耐受性的主要贡献者。值得注意的是，这些基因与药物耐受菌株中升高的胞内活性氧（ROS）水平相关。用ROS清除剂处理增加了这些菌株对抗生素的敏感性。这些结果表明，代谢基因表达的变化在药物耐受性的发展中起着至关重要的作用，而ROS代谢的调控可能是药物耐受菌更广泛代谢改变的核心。
IMPORTANCE
金黄色葡萄球菌因其显著的发展抗生素耐受性的能力而对公共卫生构成重大威胁，常导致治疗失败和耐药性出现。本研究为其潜在的代谢机制提供了关键见解。蛋白质组学分析显示，耐受菌株中不同的遗传突变汇聚于相似的基因表达变化，这些变化直接影响了耐受表型。值得注意的是，耐受菌株表现出升高的胞内活性氧（ROS）水平，而ROS清除剂处理增加了其抗生素敏感性。这些发现表明，核心代谢基因表达的转变对于金黄色葡萄球菌抵御抗生素压力至关重要，其中ROS代谢调控是赋予药物耐受性的更广泛代谢适应的核心组成部分。理解这些代谢基础对于开发针对持续性、耐受性金黄色葡萄球菌感染更有效的治疗方法至关重要。所鉴定的代谢靶点和ROS调控方法为对抗日益严重的抗生素耐药性提供了有前景的策略。
INTRODUCTION
作为导致显著发病率和死亡率的主要因素之一，抗生素耐受性近年来引起了广泛关注。然而，针对特定抗生素的耐受表型与遗传突变的不一致性表明，可能存在除突变之外有待探索的机制。与抗生素耐药性不同，耐受性不涉及抗生素靶向基因的突变；它增强了细菌群体在环境压力下的存活能力。一旦抗生素浓度降低或消除，存活的细胞可以重新繁殖，导致复发性慢性感染。更重要的是，抗生素耐受性的出现使细菌能够进化出抗生素耐药表型。因此，彻底理解耐受性形成的机制对于开发新的抗菌疗法至关重要。
金黄色葡萄球菌是一种与严重疾病相关的常见病原体，包括菌血症、心内膜炎和各种相关感染。由于金黄色葡萄球菌导致的治疗失败发生在大约四分之一的患者中，常导致频繁复发和高死亡率。使耐受性金黄色葡萄球菌对现有抗生素重新敏感已成为一个关键的研究焦点。目前关于金黄色葡萄球菌耐受性的研究主要集中在识别与表型耐受性形成相关的遗传因素以及所涉及的环境触发因素。然而，针对特定抗生素的耐受表型与遗传突变的不一致性表明，可能存在除突变之外的其他机制。
代谢重塑在细菌耐受性发展中的重要作用已日益得到认识。细菌细胞的代谢变化是影响其对抗生素固有敏感性的关键生理因素。事实上，代谢状态日益被认为是抗生素耐受性的关键决定因素，即细菌在没有遗传耐药机制的情况下，能在短暂的高抗生素浓度下存活。例如，细菌持留等现象通常与休眠代谢状态和ATP耗竭有关。特定的代谢途径，如TCA循环，已被证明具有异质性表达，有助于持留细胞的形成。虽然一些代谢物，如α-酮戊二酸和外源性谷氨酸，可以增强抗生素的杀菌效果，但允许细菌耐受抗生素的潜在代谢重编程通常涉及更广泛的代谢活性降低或向特定生存导向代谢状态的转变。
尽管与耐受性相关的突变具有多样性，我们假设这些不同的进化轨迹最终会在基因表达水平上汇聚于共同的、非遗传性的变化。我们进一步假设，这种趋同的表达重编程建立了一个共享的生理状态——特别是改变的代谢和氧化还原环境——这是耐受表型的核心。因此，本研究旨在鉴定独立进化的金黄色葡萄球菌耐受谱系中的核心代谢基因集，并阐明它们的表达模式如何被重编程以调节细胞氧化还原平衡，并最终赋予多药耐受性。
RESULTS
趋同代谢适应是抗生素耐受性的基础
在之前的研究中，金黄色葡萄球菌Newman菌株在不同抗生素中进化，并分离出进化后的菌株。然后，使用三种不同类型的抗生素（环丙沙星、苯唑西林和万古霉素）评估这些菌株的多重耐受表型，选择这些抗生素是因为它们具有不同的杀菌机制。这些菌株的基因组中存在不同的遗传突变。然而，与之前的工作不同，生长缓慢或较长的延滞期并不能解释耐受性，因为大多数耐受菌株和野生型细胞的生长速率相似。基于这些发现，我们后续的工作重点研究了所有七个耐受菌株，以揭示其耐受性的潜在机制。
为了确定定义多药耐受表型的稳定的、固有的生理变化，我们进行了定量蛋白质组学分析，比较七个进化后的耐受菌株与祖先Newman野生型菌株。所有菌株在相同的、无抗生素的条件下于稳定期培养。该实验设计特意选择用于分离在耐受性进化过程中已固定的基础蛋白质组改变。随后鉴定出这七个菌株与野生型之间的404个差异表达蛋白（DEP）。其中90个在所有七个菌株中一致上调，304个下调。有趣的是，125个DEP在至少三个交叉耐受菌株中表现出相同的表达趋势（上调或下调），而62个DEP在至少四个菌株中共享，21个在至少五个菌株中共享，8个在至少六个菌株中共享，2个在所有七个菌株中共享。这些发现表明，可能存在负责细菌适应不同抗生素的代谢基因的相似或相同的表达变化。
我们接下来使用基因本体（GO）富集分析了DEP。对所有DEP的超几何检验揭示了分子功能的显著富集，如氧化还原酶活性、NAD结合和GTP结合，这些都在细胞代谢中起关键作用。重要的是，各种代谢过程，包括糖酵解、碳水化合物代谢和de novoIMP生物合成，在一些菌株中富集，表明细菌可能改变代谢通量以维持耐受表型。此外，DEP与转录和翻译相关过程相关，包括翻译、核糖核蛋白复合物形成、核糖体结构、rRNA结合和细胞外区域。由于转录和翻译是细胞中最耗能的过程之一，它们的改变可能导致代谢通量的转变，这是交叉耐受性的关键。总体而言，我们的结果表明，来自不同药物的耐受菌株进化出相似的蛋白质表达模式，这可能是由代谢变化驱动的。
核心代谢基因被确定为多药耐受性的关键介质
为了确认代谢改变对多药耐受性的影响，选择了27个基因进行进一步研究，选择依据包括统计显著性、表达倍数变化以及在耐受菌株中观察到的DEP频率。我们在三个耐受菌株（FLU-P20-5, CIP-P17-8, 和 OXA-P13-5）中创建了这些基因的缺失（如果基因上调）或过表达（如果基因下调）突变体。基因缺失或过表达的效率通过定量实时PCR验证。测试了这些进化菌株和突变体对抗生素的耐受性，并用耐受指数（TI）表示。每个菌株对每种抗生素的相对TI率通过热图可视化。大多数经过基因操作的突变体对三种抗生素之一表现出增加的敏感性。这些结果证实了代谢相关基因表达的变化对多药耐受表型有直接影响。
正如预期，不同抗生素对突变菌株的抗菌活性各不相同。特别是，环丙沙星对源自OXA-P13-5的突变体显示出比源自FLU-P20-5和CIP-P17-8的突变体更强的杀菌活性。类似地，这些DEP对耐受表型的影响表现出一定程度的菌株特异性。幸运的是，一些DEP的表型效应独立于菌株和抗生素。我们认为这些DEP在细菌多药耐受性的发展中起着核心作用。这些核心基因涉及双组分传感（NWMN_0676/7）、渗透剂转运（opuCB）、谷氨酸合成（gltD）、氧化还原平衡（adhE）、蛋白水解（clpP）和DNA修复/重组（rarA）等途径。值得注意的是，NWMN_0676和NWMN_0677，也称为SaeQ和SaeP，是双组分系统SaeRS的辅助组分。删除SaeP或SaeQ中的任何一个都会破坏P-SaeR的去磷酸化，从而改变SaeRS介导的信号转导。因此，我们仍然认为缺失任一基因会导致多药耐受表型的缺失，尽管无法生成特定的突变体。
这些核心基因的鉴定，包括氧化还原活性酶AdhE（乙醇脱氢酶），提供了将特定代谢途径与耐受性联系起来的功能验证。这一发现，结合我们最初的蛋白质组学分析（该分析揭示了耐受菌株中众多具有氧化还原酶活性的蛋白质的表达改变），强烈指向细胞氧化还原失衡是观察到的多药耐受性下一个潜在的临界和趋同特征。
氧化还原稳态是广谱抗生素耐受性的基础
确实，蛋白质组学数据强调了药物耐受菌株中10个编码氧化还原酶活性的DEP，表明耐受性的形成可能与细菌氧化还原状态的改变有关。ROS是改变细胞氧化还原电位的关键因素。之前的几项研究发现，细菌在抗生素杀伤过程中会产生大量ROS。然后，我们使用荧光染料DCFH-DA测量了稳定期培养物中的ROS水平。有趣的是，我们的结果表明所有耐受菌株中的ROS水平均升高。为了确定这种升高的基础ROS水平在抗生素挑战期间对耐受表型是否具有功能重要性，我们用ROS清除剂处理了这些菌株。如图所示，添加清除剂显著降低了所有耐受菌株在整个抗生素处理过程（环丙沙星8小时；苯唑西林和万古霉素24小时）中的存活率，有效地使它们对抗生素重新敏感。这一结果证实了组成性较高的胞内ROS水平不仅仅是一个相关性生物标志物，而是在长期抗生素压力下维持药物耐受性的关键功能贡献者。为了确定这七个核心基因是否直接影响胞内ROS，我们测量了相应基因缺失或过表达突变体中的ROS水平。出乎意料的是，缺失NWMN_0676/7、opuCB或gltD以及过表达adhE、clpP或rarA均导致ROS水平降低。这一结果暗示细菌可能通过调控代谢基因的表达来调节胞内ROS水平，并进化出对抗生素的适应。
DISCUSSION
趋同蛋白质组重编程作为进化耐受性的标志
本研究阐明了金黄色葡萄球菌中一种趋同的代谢和氧化还原适应策略，该策略赋予多药耐受性。一个关键发现是，尽管进化菌株的初始抗生素选择压力和潜在的遗传突变不同，但这些谱系一致地汇聚于其蛋白质组谱的相似改变。这一观察挑战了特定遗传突变是耐受表型的唯一驱动因素的范式。虽然许多研究已经确定了与抗生素耐受性相关的遗传变异，但我们的发现与日益增长的认识相一致，即此类突变对于耐受性的出现并不总是严格必需的。我们的实验设计，即在无抗生素条件下分析进化菌株的基础蛋白质组，特意选择用于分离定义耐受状态的稳定的、固定的生理变化。这与分析对抗生素应激的急性反应的蛋白质组学研究形成对比，后者通常识别细胞壁合成途径和其他直接应激反应的立即上调。我们的方法过滤掉了这些瞬时反应，揭示了基因表达模式的趋同重编程。确实，非遗传性的耐受状态，如持留和表型异质性，强调了非遗传机制的重要性。
我们的结果强烈表明，金黄色葡萄球菌中药物耐受性的发展主要是由基因表达模式的动态重编程所 orchestrate，而不是由一组固定的赋予耐药性的突变所驱动。在抗生素压力下，由这些表达变化驱动的赋予生存优势的表型可以在群体内积累，并可能被正反馈机制所强化。当环境压力源是抗生素时，这种适应性反馈的结果就是药物耐受性的出现。尽管进化背景不同，但独立进化的耐受菌株在表达模式上的显著相似性表明，金黄色葡萄球菌通过改变基本细胞过程的共同改变来导航通往耐受性的进化路径。对抗生素耐受性及其固有可塑性的分子基础的理解具有重要的治疗意义。具体来说，它表明，靶向控制代谢基因表达的调控网络，或由此类表达变化产生的代谢脆弱性，可能代表一种更有效和广泛适用的策略，用于对抗药物耐受性细菌群体的出现和持续存在，而不是仅仅依赖于识别和靶向与经典耐药性相关的特定遗传突变的方法。
核心代谢基因表达在驱动多药耐受性中的关键作用
基于对趋同蛋白质组谱的观察，我们的研究鉴定了一组核心的七个基因，它们的表达模式在耐受分离株中一致改变，并经过功能验证是多重耐受表型的主要贡献者。这些基因包括NWMN_0676和NWMN_0677（SaeRS双组分调控系统的辅助组分）、OpuCB（甘氨酸甜菜碱/肉碱转运的渗透酶，参与渗透胁迫反应）、GltD（谷氨酸合酶的一个亚基，对氮代谢和氨基酸生物合成至关重要）、AdhE（参与发酵和氧化还原平衡的醇醛脱氢酶）、ClpP（ATP依赖性Clp蛋白酶的蛋白水解亚基，是蛋白质质量控制的核心）和RarA（DNA复制和修复蛋白）。我们的蛋白质组学方法揭示了耐受性的进化与这些核心基因的趋同表达变化密切相关，其中许多是与基础代谢相关的新型效应器，并受SaeRS系统调控。我们注意到这种机制与其他使用不同选择压力（如膜靶向抗生素达托霉素或人血清）的适应性进化研究中观察到的机制不同。那些研究表明细菌优先通过细胞壁特定调控组分（尤其是WalKR和GraSR双组分系统）的遗传突变进化出耐药性。这些发现强调了耐受性获取的复杂性，指出稳定的遗传变异和趋同的基因表达重编程都是金黄色葡萄球菌用于在抗生素压力下存活的至关重要的进化策略。
这些核心基因在耐受背景下的靶向操作（缺失或过表达）直接影响它们对多种抗生素的敏感性，证实了它们表达的改变不仅仅是相关性，而是耐受状态的功能性决定因素。这种在我们的进化分离株中观察到的蛋白质组与适应性之间的直接、功能验证的相关性，呈现了一个清晰的蛋白质组-适应性关联案例。我们承认这一发现与其他重要的研究不同，那些研究观察到表达-适应性解耦，即分子丰度的变化并不总是对应于基因对适应性的贡献。例如，Freiberg等人在金黄色葡萄球菌生物膜中的一项相关研究清楚地证明了这种解耦：虽然精氨酸脱氨酶途径蛋白在抗生素胁迫下上调，但转座子测序显示它们的基因没有显著的适应性贡献。虽然这种解耦凸显了解读“组学”数据的复杂性，但我们自己的结果提供了一个强有力的证明，即对于这七个核心基因集，我们鉴定出的趋同蛋白质组改变是多药耐受表型的功能驱动因素。这些发现强调细菌对抗生素胁迫的适应涉及多种细胞途径的协调重塑，包括信号转导、营养摄取、中心代谢、氧化还原稳态、蛋白质周转和DNA维持。这组核心基因在耐受不同类别抗生素的菌株中持续存在，指向金黄色葡萄球菌采用的一种共享的、基本的适应性策略，以抵御抗生素杀伤。
升高的胞内ROS：被进化菌株利用的促耐受信号
药物耐受性金黄色葡萄球菌菌株的一个显著生理特征是胞内ROS水平显著升高。至关重要的是，这些耐受菌株在抗生素挑战下增强的存活率通过ROS清除剂处理被显著削弱，表明这些升高的ROS水平具有功能性的、促耐受作用。进一步的研究揭示，已鉴定的核心代谢基因的表达变化与这种改变的氧化还原状态直接相关。这表明金黄色葡萄球菌可能通过调控这些核心基因的表达作为对抗抗生素暴露的适应性策略，主动调节其胞内ROS环境。
ROS在抗生素作用背景下的角色是复杂且常常看似矛盾的。虽然许多研究表明暴露于杀菌性抗生素可引发胞内ROS激增，导致细胞损伤和死亡，但我们的发现以及其他研究提示ROS也可以发挥保护作用。可以设想，在我们的耐受菌株中观察到的由特定代谢重编程导致的持续、适度升高的ROS水平，作为关键的信号分子发挥作用。此类ROS信号可以激活保护性应激反应途径或调节其他代谢基因的表达，从而促进在抗生素压力下有利于存活的适应性生理状态。这种情况与急性高、不受控制的ROS爆发超过细胞解毒和修复能力，导致广泛的大分子损伤和细胞死亡的条件形成鲜明对比。这种提出的ROS功能的情境依赖性二元性，是解释其在观察到的复杂细菌应激反应中不可或缺作用的一个关键假设。
代谢重编程：与细胞生物能量学和应激适应的相互作用
我们的发现与越来越多将深刻的代谢转变（尤其是关于能量代谢）与细菌持留和抗生素耐受性联系起来的文献强烈共鸣。开创性研究表明，降低的ATP水平（通常由中心代谢途径如三羧酸循环中酶的随机表达驱动）是持留细胞的一个标志，并显著贡献于其抗生素顽固性。此外，ATP耗竭已被证明可以降低翻译效率，这是细菌耐受性的一个关键因素，这一观察与我们通过蛋白质组学分析在药物耐受性金黄色葡萄球菌菌株中发现的翻译相关过程的改变相一致。
虽然我们的研究没有直接量化细胞能量电荷，但几条证据指向耐受菌株内生物能量的显著改变。蛋白质组学分析揭示了与ATP合成相关途径中蛋白质的下调。GO富集分析也强调了糖酵解和碳水化合物代谢的改变——这些过程与细胞能量水平内在相关。观察到的能量密集型过程（如翻译）的下调，进一步支持了向更低能量状态或代谢资源重新排序的潜在适应。
ROS与细胞能量状态之间的相互作用是复杂的；升高的ROS可通过损伤呼吸链组分来损害ATP合成，而受损的能量代谢导致电子传递链停滞，其本身可能促进ROS产生增加。我们耐受菌株中升高的ROS水平既可能是潜在改变的细胞能量状态的结果，也可能是其促成因素，创造一个促进耐受性的强化反馈循环。总的来说，我们的发现强烈表明，金黄色葡萄球菌耐受表型基础的代谢重编程可能涉及细胞生物能量的显著调节，有助于在抗生素胁迫下增强存活。
来自特定核心基因的功能见解：ClpP和精氨酸代谢
在表达改变与耐受性相关的核心基因中，clpP和arcA提供了特定代谢节点影响此表型的引人注目的例子。编码Clp蛋白酶蛋白水解亚基的基因clpP在所有七个耐受菌株中持续下调。我们的功能测定证实了这种下调的重要性，因为在耐受背景中过表达clpP使细胞对抗生素更敏感。这表明降低的基础ClpP介导的蛋白水解有助于维持多药耐受表型，可能是通过稳定对应激适应至关重要的蛋白质。这一发现与Conlon等人的工作形成了有趣的互补，他们证明了通过ADEP4对ClpP进行药理学激活和失调是根除休眠金黄色葡萄球菌持留细胞的高度有效策略。在该背景下，ADEP4将ClpP转化为非特异性、不受控的蛋白酶，强制致命的自我消化，这种机制绕过了休眠细胞中常规抗生素靶点的失活。因此，虽然受调控的ClpP活性减少可能是天然耐受策略的一部分，但ClpP蛋白酶本身代表了一个可利用的关键脆弱性。我们观察到的下调甚至可能使这些耐受细胞特别依赖于它们剩余的基础ClpP功能，或对ClpP激活剂的失调效应更敏感。
此外，我们的蛋白质组学分析鉴定了一个精氨酸代谢基因arcA的表达改变，该基因在三个耐受菌株中下调。我们的结果，结合近期文献，证实整个精氨酸代谢网络是抗生素耐受性的中心枢纽。确实，该网络的合成分支，由argF和argH等基因控制，代表了诱导耐受性的关键开关。最近的工作证明限制精氨酸合成是金黄色葡萄球菌中多药耐受性的有效诱导剂。所识别的机制是诱导relA依赖的严谨反应，导致蛋白质合成抑制。与合成分支互补，由arc操纵子编码的精氨酸脱氨酶途径作为一个活跃的代谢应激反应模块，具有多方面的作用。在应激和酸性生物膜环境中，ADI途径激活对于化脓链球菌的耐受性至关重要，因为它产生氨来缓冲胞内pH。这种保护功能是保守的，因为在粪肠球菌和变形链球菌中激活ADI途径也会增加抗生素耐受性。这些研究通常将arc上调与主动防御联系起来，而我们的蛋白质组学数据在我们的耐受菌株中识别出arcA下调。我们提出，在我们使用的营养丰富的TSB培养基中，进化菌株通过不同的代谢策略实现促耐受生理状态：下调分解代谢的arcA途径以保存内部精氨酸库。鉴于精氨酸也是宿主一氧化氮合成的前体，这个代谢节点可能代表了体内细菌代谢、氧化还原感应和宿主免疫反应之间的关键且复杂的接口。
更广泛的背景：耐受性中的内源性ROS、宿主-病原体相互作用以及抗生素诱导ROS的辩论
ROS在抗生素作用中的角色一直是重大辩论的主题。Kohanski等人的开创性工作提出ROS产生是多种杀菌性抗生素致死性的共同下游机制，表明抗生素刺激代谢活动导致ROS生成，从而损伤细胞组分。虽然该模型获得了相当大的关注，但它受到了诸如Keren等人研究的挑战，他们发现
