蓝细菌生物肥料的胍类合成酶工程
引言
为应对全球粮食需求，肥料在提供植物生长必需养分方面具有关键作用，其中氮元素最为重要。当前合成氮肥通过高能耗的Haber-Bosch工艺生产，凸显了对可持续肥料替代品的迫切需求。蓝细菌生物肥料因其能将大气气体转化为有价值有机化合物而被视为传统化学肥料的有前景替代品。某些蓝细菌通过固氮酶将大气氮气转化为铵，这些固氮蓝细菌还通过增强土壤孔隙度促进土壤团聚和肥力，改善水气循环，在细胞内保持水分并向土壤释放有益物质。相关行业正在积极推广微生物生物肥料技术，当前研究包括旨在改善生物固氮和肥料效率的基因工程。
现有含氮肥料产品包括铵、尿素等，但这些化合物存在缺陷。理想情况下，生物生产的氮肥应是有机、富氮且酶不稳定的分子。胍按质量计含有71.1%的原子氮，由于其缓释特性，表现出优于其他氮化合物的肥料效率。植物通过根部从土壤吸收胍，并且显示出高于其他氮源的吸收率。与尿素和硝酸盐等传统氮肥不同，胍在植物体内以其原始形式存在，作为无机氮代谢的下游分子。其通过胍降解酶逐渐降解为尿素和氨，确保在作物生长期间提供更简单形式的氮。此外，胍的挥发性低于氨，可增强农田氮保留并降低相关成本。
概念性策略：设计蓝细菌生产胍
设计蓝细菌胍生产系统的第一步涉及发现合适的酶并确定关键催化步骤和潜在瓶颈，这将指导合理设计选择。迄今为止，已鉴定出多种能够产生胍的酶。乙烯形成酶（EFE）的初步演示涉及来自丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）致病变种PK2的基因重组表达。该Fe(II)/2-氧戊二酸依赖型加氧酶（2-ODD）催化的反应如下：AKG + 3 O2+ L-精氨酸 → 2乙烯 + 琥珀酸 + 7 CO2+ 胍 + P5C。在此过程中，当EFE在大肠杆菌中表达时，胍作为精氨酸氧化反应产物以1:2的比例出现。与此观察一致，Wang等人报道了通过EFE反应在蓝细菌中形成胍，并创造了胍生物合成（GUB）循环一词来描述显然为从铵和CO2产生胍并回收P5C而运作的反应集合。该GUB循环不会对蓝细菌造成显著的代谢负担。在EFE将约10%的固定碳重定向用于乙烯生产的菌株中，生长速率与野生型几乎相同。ATP和NADPH的总体生成和消耗水平增加了近20%。流向AKG的碳通量增加了3倍以支持乙烯生产。尽管缺乏直接实验证据，但代谢可塑性可能也适用于氮通量以实现更高的精氨酸/胍生产率，这值得进一步研究。
尽管EFE已证明在蓝细菌系统内合成胍的能力，但EFE的变体或同一家族内的相关酶可能具有更优的酶学特性。一些先前的研究已经鉴定出乙烯产量低于P5C产量的酶，这可能意味着更高的胍合成效率已经完成。控制2-ODD家族酶活性的关键残基和配位环境为理解胍生产的机制提供了宝贵的见解。该酶家族使用铁(II)作为辅因子。精氨酸和AKG是主要底物。它们结合在2-ODD家族酶活性位点内的铁中心附近。结合引起酶活性位点的显著构象变化。Martinez等人检查了丁香假单胞菌EFE的几种与不同金属和底物共复合的突变体，以阐明反应机制。这些变体之间观察到的乙烯形成和P5C形成反应分配变化表明存在不同的胍生产水平。此外，已鉴定出其他能够产生胍的酶。例如，拟南芥中2-氧戊二酸依赖型双加氧酶（2-ODD）C亚家族成员Din11，最近证明了从精氨酸产生胍。此外，称为NapI的酶，一种精氨酸-4,5-去饱和酶，在萘啶霉素的生物合成过程中催化精氨酸C4–C5键的去饱和，通过不稳定的前体5-羟基精氨酸产生胍。这些发现表明，研究2-ODD家族内的新型酶可能揭示这些未被充分研究的酶在胍生物合成方面的新能力。将研究工作扩展到细菌和真核生物可能发现能够催化类似于EFE和2-ODD家族内其他特征酶反应的额外物种，这些酶可能具有改进的动力学或更高的胍乙烯比。
有效的酶促胍生产取决于足够的底物可用性。刺激底物生成的策略，如途径优化和通量增强，在工程系统设计阶段至关重要。这些底物的可用性可能成为限速因素，显著影响总产量。蓝细菌具有体内合成这些底物的能力。精氨酸是通过N2固定或吸收产生的氮化合物，然后通过鸟氨酸-精氨酸-瓜氨酸（OAC）循环合成的，而AKG是三羧酸（TCA）循环中的中间体。工程蓝细菌已显示出代谢可塑性，增加了碳流入TCA循环，补充了AKG库。AKG可用性的增加促进了谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）循环，这可能导致更多的精氨酸合成。
为了增加胍产量，必须通过调节代谢通量以利于胍合成来利用蓝细菌的代谢适应性。首先，为了增加AKG可用性，过表达异柠檬酸脱氢酶（IDH）有可能通过将额外的异柠檬酸转化为AKG来增加TCA循环内的AKG可用性。此外，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化PEP羧化为草酰乙酸，提供了一种绕过主要氧化途径的能量高效替代途径。这些途径的调节也必须考虑。全局信号蛋白PII通过根据AKG的细胞内水平和ATP/ADP比率调节ntcA和PEPC的活性而起关键作用。当在能量充足的条件下AKG与氮的比率下降时，PII与PEPC相互作用以促进碳通量流向AKG。PEPC的过表达导致表达EFE的工程集胞藻菌株中乙烯产量增加，表明胍产量可能相应增加。关于另一种底物精氨酸，它是通过两阶段过程合成的：第一阶段将谷氨酸转化为鸟氨酸，第二阶段通过鸟氨酸-氨循环（OAC）将鸟氨酸转化为精氨酸。一旦谷氨酸通过GS-GOGAT途径从固定氮合成，它就被输入精氨酸生物合成途径。然后谷氨酸通过几个酶促反应转化为鸟氨酸。通过这些反应的流量受PII蛋白与N-乙酰-L-谷氨酸激酶（NAGK）或ArgB的结合调节，当氮充足时增强精氨酸合成。随后，OAC过程以鸟氨酸为起始材料开始。关键的酶促步骤包括L-精氨酸脱羧酶（ArgZ）、精氨琥珀酸裂解酶（ArgH）、精氨琥珀酸合成酶（ArgG）和鸟氨酸氨甲酰转移酶（ArgF）。关于精氨酸利用，ArgZ通过其双水解酶活性将合成的精氨酸转化回鸟氨酸，在调节细胞内精氨酸水平方面起重要作用。删除argZ可能是增加可用于胍合成的细胞内精氨酸浓度的一种策略。然而，如果未被胍生产完全消耗，较高的精氨酸浓度对其他调节途径（包括PII对PEPC的调节）的影响可能会减少氮同化。其他几种遗传干预可能进一步改变精氨酸和谷氨酸代谢以支持胍生产。删除或下调谷氨酸合成酶（gltBD）去除AKG的竞争途径，从而可能增强胍生产。此外，敲除putA阻止从精氨酸、鸟氨酸或脯氨酸合成谷氨酸，允许这些前体被转向胍生物合成。proB编码谷氨酸-5-激酶，将谷氨酸转化为谷氨酸-5-磷酸（G5P）。然后，proA编码谷氨酸-5-半醛脱氢酶（GDH），将G5P还原为谷氨酸-5-半醛。删除proAB预计通过限制脯氨酸合成并将通量转向胍生产酶来促进胍生产。除了生物合成和降解，蓝细菌将过量氮储存为蓝藻藻蓝素，这是一种在解聚时释放游离精氨酸和天冬氨酸的生物聚合物。调节蓝藻藻蓝素合成酶（CphA）可以调节其合成，从而将更多的精氨酸从胍生产转移出去。
调节胍生产和输出的遗传工具
实施设计的途径需要强大的遗传和细胞工程策略工具包。开发这些工具时，必须仔细评估生物量生长和光合作用。为了获得低代谢应变的高产物产量，可以采用各种策略。高水平的方法，如转运体工程、启动子调节和宿主生物选择，为构建能够控制胍生产和输出的系统提供了基础。开发基于胍的生物肥料不仅仅是在蓝细菌内合成胍。另一个关键组成部分包括增强其细胞外胍可用性以供实际应用。我们上面讨论了对各种酶和基因工程靶点的研究，以促进有效的底物供应。虽然较高的胍产量是可取的，但其在细胞内的积累会导致蓝细菌中毒性，损害色素代谢并导致蛋白质变性。因此，了解这些生物体内的胍代谢和运输至关重要。
几种蓝细菌拥有将胍通过尿素或羧基胍和脲基甲酸盐转化为氨的天然途径。一旦胍被合成，胍依赖性核糖开关可以打开和关闭胍降解基因，这有助于维持细胞胍稳态。在集胞藻PCC 6803中，一种Ni2+依赖性胍水解酶（GdmH）将胍水解为尿素和氨，其成熟蛋白（GhaA和GhaB）在该操纵子中编码。此外，在同一操纵子内发现了一个用于输入胍的ABC转运体，使得能够利用胍进行微生物生长。为了最大化胍产量，需要有效的胍输出而不是降解。一些蓝细菌拥有天然输出器，而对于其他蓝细菌，可以采用转运体的异源表达。最近，一种天然蓝细菌多药外排转运体PrqA被证明能够输出胍。大肠杆菌的称为Gdx的转运体，由sugE编码，也可以促进胍离子（Gdm+）输出，同时由于跨膜域的疏水性排除其他极性胍基化物质。由于外排泵影响膜系统，实现成功的胍输出同时最小化细胞损伤对于细胞稳定性至关重要。
此外，酶促胍生产可以被优化，基因表达水平可以通过修改表达系统内的组件来平衡，以保持细胞健康，例如启动子、核糖体结合位点（RBS）、基因本身和终止子。最初，调整可能侧重于调节负责胍合成的基因表达。一种直接的方法是通过使用具有高效复制起点的高拷贝数质粒或将多个基因拷贝整合到宿主染色体DNA中来增加基因剂量。探索不同的启动子或加入相同启动子的额外拷贝可能达到所需的基因表达水平。组成型启动子的候选包括调节RuBisCo表达的rbcL或天然集胞藻启动子，如光诱导型psbA2和氮诱导型nit1，根据具体情况选择。诱导型启动子通过切换胍合成途径的开关实现两阶段生产策略。在生长阶段，胍生产关闭；一旦细胞达到健壮状态且不再竞争最大光合作用，该途径被激活。对于需要降低表达的条件，天然启动子更可取。此外，来自大肠杆菌的混合启动子如trc、lac和tac通常用于获得稳健的表达系统。根据目标，可以调整5'-非翻译区（UTR）长度：较短的用于有效的翻译起始，较长的用于容纳添加的调控元件。从翻译角度看，最佳的5'-UTR和RBS影响目标蛋白的合成水平。有设计软件工具可预测RBS序列；然而，由于生物体特异性特征，这些工具在蓝细菌中的准确性已显示出局限性。尽管存在此限制，预测工具可帮助创建RBS文库，用于手动测试各种RBS以评估胍生产。此外，用His标签或GST标签标记基因可以简化蛋白质纯化。最后，终止子确保转录的完全终止。
鉴于这些策略，选择合适的底盘进行基因工程是基于各种因素的关键步骤。重要的考虑因素包括遗传可操作性，如可用的注释基因组、基因编辑工具、转化方法和启动子，以及生理特性如生长速率和鲁棒性，和生物安全性问题如非致病性。因此，模式蓝细菌是胍生物生产的有希望的起点。非固氮选项包括集胞藻PCC 6803和聚球藻PCC 7942。对于固氮细菌，候选菌如鱼腥藻PCC 7120和 Cyanothece sp. ATCC 51142是合适的。这些蓝细菌的优缺点总结在表2中。
实施概念设计后，需要进行严格评估以评估系统性能。测试框架应侧重于胍产量、底物通量和分泌效率等指标，采用高通量和定量分析以支持迭代改进。除了遗传考虑，代谢通量分析可以识别途径瓶颈并指导DBTL框架内的靶向基因工程。
蓝细菌生物肥料的实际应用
最终目标是将开发的蓝细菌胍生物肥料技术部署用于农业。基于先前蓝细菌生物肥料的应用，有几种提供蓝细菌生产的胍的方法。首先，生产胍的活蓝细菌可以直接施用于土壤。作为传统方法，用蓝细菌浇灌土壤或将蓝细菌与蚯蚓粪混合可提高作物产量。通过将幼苗根部浸泡在蓝细菌中进行预处理也已被证明可以改善作物生长和产量，这似乎适用于胍生产者通过将胍运输到种子。其他方法，如基于粘土的接种和与常规氮肥混合，可能有助于通过利用蓝细菌胍实现水稻和营养作物的高产。
除了土壤，叶面喷施蓝细菌肥料显示出前景，因为叶子是光合作用的活跃部位。已知叶面养分施用对于从叶子开始的养分吸收是有效的。此外，它通过增加氮代谢（包括硝酸还原酶和谷氨酸合成酶）来增强叶子的健康，并通过维持水杨酸途径的活性来增强植物免疫力。蓝细菌的叶面施用增加了叶子中的氮代谢活性，包括硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶。蓝细菌的施用通过维持水杨酸途径的活性来增强植物免疫力。在水培系统中，添加蓝细菌也提高了作物产量。如本文所述，遵循DBTL框架进一步优化氮化合物生产和蓝细菌生物肥料的有效施用方法，将通过克服放大和确保功效的实际挑战，增强该技术的可行性和应用。
结论
从蓝细菌生产胍代表了一种有前景的生物肥料技术。蓝细菌的光合固氮可以解决高能耗工业过程的经济限制，将其定位为胍生物肥料生产的强大宿主。本文提出了实现高效胍生产的策略以供未来的研究工作。作为初始步骤，必须设计和鉴定用于胍重组生产的胍生产酶。将一种铁和AKG依赖的加氧酶（一种利用精氨酸的酶家族）引入固氮蓝细菌显示出巨大潜力。对相关代谢途径的透彻理解有助于识别胍生产中的瓶颈。合成生物学工具进一步促进胍基因合成的控制，简化胍从细胞中的输出将提高过程效率。使用迭代DBTL框架来组织蓝细菌胍生产策略，可以在这个新兴领域识别关键挑战和机遇。
